用于分离靶细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于样品中的靶细胞的富集和/或分离的方法，所述样品包括红血球和/或血小板，所述方法包括：(a)通过具有孔径或目径在0.5μm和5μm之间的滤器元件过滤所述样品；(b)使被步骤(a)中的所述滤器元件保留的细胞与分离表面接触，其中所述分离表面包括选择性结合至所述靶细胞的亲和分子；(c)在允许所述亲和分子至所述靶细胞的结合的条件下，孵育所述细胞和所述分离表面；以及(d)将所述分离表面与任何未结合的细胞和材料分离。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种用于样品中靶细胞的富集和/或分离的方法，所述样品包括红血球和/或血小板；所述方法包括(a)通过具有在O. 5 μ m和5 μ m之间的孔或目径的滤器元件过滤样品；(b)使在步骤(a)中被滤器元件保留下来的细胞与分离表面接触，其中所述分离表面包括选择性结合至靶细胞的亲和分子；(C)在允许亲和分子与靶分子结合的条件下孵育上述细胞和分离表面；及(d)把分离表面与任何没有结合的细胞和材料分离。
技术介绍
已在临床研究中示出了播散的肿瘤细胞(DTC)(即在癌症患者的外周血或骨髓中可检测的肿瘤细胞)在癌症患者的诊断及治疗结果的评价方面提供信息价值。除此之外，在很多情况中这些细胞具有在疾病的早期指示肿瘤发生的能力。 例如，对乳腺癌患者的研究显示患者血液中的播散的肿瘤细胞的检测与无进展的存活和完全存活的降低显著相关(Gaforio等(2003) Int. J. Cancer, 107 (6) :984-90 ；Stathopoulou 等(2002) J. Clin. Oncol. ,20(16) :3404-12)。在其它类型癌症中进行的研究中获得了类似的结果(Koch 等(2005)Ann. Surg. ,241(2) :199-205 ;Kinele 等(2003)Ann.Surg. , 238 (3) :324-30)。因此，在癌症患者的血液或骨髓中存在的播散的肿瘤细胞的准确监控提供了用于治疗优化和预测病程的有用的参数。另外，从原发肿瘤的肿瘤细胞的血源性扩散也被认为在转移灶的发展中起作用(Eccles S. A. & Welch D. R. (2007)，Lancet，369，1742-1757)。转移灶的形成(而不是原发肿瘤本身的进展)是导致肿瘤疾病中的死亡的主要原因。因此，用于转移灶形成的早期标志的检测对应用至癌症患者的治疗方案极其重要。目前，通过使用包括结合至肿瘤细胞的确定的表面抗原的抗体的磁珠常规地进行播散的肿瘤细胞的检测和分离。这些修饰的珠子与个体的血液样品孵育以特异性结合样品中存在的肿瘤细胞。但是，目前可用的技术与非特异的细胞吸附至珠子的高程度，以及肿瘤细胞的低检测率相联系。已知由于样品中的非靶细胞(尤其是红血球细胞)的数量很大，因此不能确保在常规使用的方法中样品中的每个肿瘤细胞均与珠子的抗体呈现表面相互作用足够长的时间，以便发生固定的抗体和靶细胞之间的结合。相反，样品中有效数量的肿瘤细胞将不用它们对应的捕获分子接触。因为该原因，现有技术中做了尝试以移除红血球，以便富集样品中的肿瘤细胞。例如，使用了使用特异的密度梯度介质(诸如Ficoll、Nycodens、Nycoprep等)的密度梯度离心。为了该目的所采用的介质具有在红血球和有核细胞的密度之间的密度。通过离心，红血球和有核细胞变得富集在介质的不同的相中，且可通过移液管彼此分离。这种方法具有特定的缺点，即该方法是劳动密集型的且需要高度熟练的人员来进行分离。而且，播散的肿瘤细胞可能显示宽密度范围，这意味着这些细胞的一部分可能不可用于随后的亲和结合步骤。密度梯度离心的使用还需要肿瘤细胞的多次清洗步骤，这与若干不利影响诸如剪切应力和细胞非特异性吸附至反应管壁相关，其中剪切应力和细胞非特异性吸附至反应管壁可导致靶细胞的丢失。已证实通过密度梯度离心的肿瘤细胞的富集通常导致样品中存在的肿瘤细胞几乎三分之二的丢失(Choesmel等(2004)，101,693-703)。进一步地，密度梯度离心不能进行更大样品体积的处理，这在当考虑播散的肿瘤细胞以极低的浓度存在于血液或骨髓中时是明显的不利因素。在目前使用的可选择的方法中，通过向血液样品中加入裂解缓冲液诸如氯化铵来裂解红血球。通过加入裂解缓冲液，红血球的膜破裂从而导致细胞死亡和细胞内组分的释放。但是，已证实裂解缓冲液的使用还常常使样品中存在的播散的肿瘤细胞的很大部分破裂。进一步地，可假设这些缓冲液的使用将有害地影响靶细胞的新陈代谢，这对进一步的处理步骤(例如培养分离的细胞)是不利的。
技术实现思路
根据上述问题，本专利技术的一个目的是提供一种用于富集和/或分离靶细胞的改进的方法，该靶细胞与红血球和/或血小板一起存在于生物样品中；所述方法具有高回收率 且同时包含对靶细胞的温和处理，以便在处理过程中仅使少量的靶细胞破裂。尤其，该方法 将不会对靶细胞施加大量的机械或化学应力。本专利技术的另一目的是提供一种允许血液样品中的靶细胞高度特异性的结合至分离表面的方法，该方法的特征在于非靶细胞诸如红血球与所述表面的非特异性附着减少。通过所附权利要求中定义的方法达到这些目标和其它优点。本专利技术已发现通过具有特别小孔径的滤器元件过滤包含红血球和/或血小板的样品(诸如全血样品)且随后经由与靶细胞特异性结合的分离表面分离残留物中的靶细胞的组合方法产生非常高的回收率。在本专利技术的实施例中，可回收几乎100%的进行本专利技术方法的标记的靶细胞。通过初始的过滤步骤大大减少了可干扰亲和结合步骤的红血球、血小板或白细胞对分离表面的非特异性吸附。此外，已发现当与参照样品(其中通过密度梯度离心去除红血球)中的白细胞相比，已通过根据本专利技术的过滤步骤分离的白细胞显示出对分离表面低2级的非特异性结合亲和性(factor 2 lower non-specific bindingaffinity)(见图2)。因此,通过分离表面的祀细胞的回收率(也被称为淘金法(panning))比通过现有技术中的方法实现的靶细胞的回收率高很多。因此，在第一方面，本专利技术公布了一种用于样品中靶细胞的富集和/或分离的方法，其中，其中所述样品包括红血球和/或血小板，所述方法包括(a)通过具有尺寸在O. 5 μ m和5 μ m之间的孔、洞或缝隙的滤器元件过滤所述样品;(b)使被步骤(a)中的所述滤器元件保留的细胞与分离表面接触，其中所述分离表面包括选择性结合至所述靶细胞的亲和分子；(C)在允许所述亲和分子与所述靶细胞结合的条件下孵育所述细胞和所述分离表面；以及(d)从任何未结合的细胞和材料中分离所述分离表面。本专利技术的方法可应用于包括红血球和/或血小板的任何样品。优选地，所述样品包括来自个体的体液或组织提取液。优选地，样品来源的个体为脊椎动物，且更优选地为哺乳动物。在特别优选的实施方式中，上述样品来源于人。样品通常为细胞悬浮液。上述样品可包括以下物质或由以下物质组成血液(例如全血)或血液组分、尿液、胸腔积液、腹水、支气管肺泡灌洗液、女性乳房腺体的乳头抽吸液或骨髓。在优选方面，包括靶细胞的样品分别为血液或骨髓样品，例如来自人类个体的包括血液或骨髓或主要由血液或骨髓组成的样品。可通过现有技术中任何已知的方法获取样品。例如，如果样品为人的血液样品，则可通过静脉穿刺获取样品。用于获得骨髓(例如人的骨髓)的方法在本领域中也是公知的。例如，可通过通常经由微创外科手术的介入治疗从髂骨或从胸骨的隆起部位获取混合有血液的红骨髓。可选择地，生物样品可为腹水(即腹腔液体)、胸腔积液、来自女性乳头的抽吸液、尿液或其它体液。 当要在根据本专利技术的方法中使用的样品具有特别高的粘度时，可能有利地是在将样品施加在滤器元件之前或同时稀释该样品。为了该目的，可使用任何生理上可接受的缓冲液，该缓冲液不会干扰靶细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：N·丹克巴，B·布兰特，E·T·哥迪，
申请(专利权)人：汉堡大学医院埃佩多夫公司，
类型：
国别省市：