利用竞争性引物的目标碱基序列的检测方法技术

一种具有多态性碱基的目标碱基序列的检测方法，该检测方法包括：（a）在具有由包括目标碱基序列的碱基序列组成的目标核酸的核酸试样中，添加至少一种检测用引物、至少一种竞争性引物以及至少一种共用引物的步骤；（b）使所述检测用引物与所述竞争性引物通过竞争与所述目标核酸进行退火，从而合成延伸产物A的步骤、（c）使通过所述步骤（b）或后述步骤（d）而得到的所述延伸产物A与所述共用引物进行退火，从而合成延伸产物B的步骤、（d）使通过所述步骤（c）得到的延伸产物B与所述检测用引物或所述竞争性引物进行退火，从而合成延伸产物A的步骤以及（e）检测所述延伸产物A或B的步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有多态性碱基的目标碱基序列的检测方法以及用于所述方法的试剂盒。更详细地说，涉及一种通过引物的竞争高精度地检测出目标碱基序列的检测方法、以及用于所述方法的试剂盒。本专利技术基于2010年3月24日向日本专利局提出的申请号为特愿2010-68490的专利技术专利主张优先权，并将该内容引用于本申请。
技术介绍
近年来，根据全球性的人类基因组解析，已确定出31亿个碱基对序列，且确定出人类基因数量大概为3 4万个。 人类的不同个体之间存在着不同的碱基序列，若该碱基序列以特定人群1%以上的频率存在，则称为基因多态。其中，对于基因喊基序列之间的不同点仅在于单个喊基的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)而言,被认为其与各种疾病的发生具有相关性。例如，人类遗传病的病因，被认为是一个基因中单个碱基的差异。另外，生活方式病或癌症等疾病，被认为是受到了多个基因中单个碱基不同的影响而发生。由此，认为SNP的解析在药物靶标的探索或副作可的预见性等的药品开发方面非常有效。因此，SNP的解析作为全球性的重大课题而被向前推进。作为药物效果或副作用程度因人而异的原因之一，可举出每个人的与药物代谢相关的酶群的不同。最近还确定了这种差异也是因基因上的略小差异而引起。因此，提出了通过预先对患者的基因进行分析后，选出对患者最适宜的药并给予患者的方法。进而，不仅是单基因遗传病(monogenic disease),对多因子疾病(multifactorial disorder),基因诊断的意义也正在得到迅速提高。另外，对于以病原细菌或病毒为目标的药物效果来说，即便是相同种类，在每个个体之间也存在差异，这些差异大多数是由于每个个体基因上的细微差异产生的。这种作为外来因子的病原细菌或病毒的基因诊断，预计今后也增加为检测对象。如此地，在后基因时代，能够检测出人类或病原微生物基因上的微小差异、尤其是能够检测出单个碱基的差异是一件非常重要的事情，而且预计今后会越来越重要。至今，对检测出碱基序列中的细微差异、尤其是对单碱基差异的检测方法进行了各种研究(参照非专利文献广2)。然而，为了使检测达到实用水平，要求该方法为成本低、方法简便、检测时间短以及检测结果的准确度等方面都均非常优异的检测方法。但到现在为止，还没有能够满足上述要求的检测方法。在检测基因的细微差异、尤其是检测单碱基差异时，通常来讲，试样中仅含有少量的作为目标的基因片段。此时，必须通过某些方法，预先对目标基因进行扩增。作为这种基因扩增法，例如、可举出聚合酶链反应(PCR, Polymerase Chain Reaction)法。通常来说，为了检测出目标基因中的单个碱基差异，需要进行两个步骤，即基因扩增步骤和检测扩增基因中的单个碱基差异的步骤(参照非专利文献2)。然而，对于需要经过两个步骤的检测方法来说，由于包括多个步骤，因此处理起来比较复杂。为了改善这种包括两个步骤的检测方法的复杂性，例如，报道了采用附着有荧光色素和淬灭剂的探针的TaqMan法(参照非专利文献3)、或利用通过质谱仪进行DNA质量分析的基体辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-T0F/MS)法(参照非专利文献4)等。另夕卜，作为不需要进行基因扩增的检测方法，报道了采用对DNA结构进行识别并切割的酶侵入(invader)法(参照非专利文献5)。然而，若要实施这些方法，仍需要高成本，而且探针的设计也很复杂。另一方面，报道了同时进行基因扩增和单碱基识别的方法(参照非专利文献6)。该方法是，在DNA聚合酶的延伸反应中，利用了延伸反应的发生取决于引物的3’末端是否与试样中的模板DNA相互补(以下称为匹配)的原理的方法。即，在用于PCR反应的一对引物组中，如果将一引物设计成在3’末端具有与单碱基多态相互补的碱基的引物时，若引物与模板完全匹配，则发生延伸反应，且在与另一个引物之间发生扩增反应。但是，如果一个引物与模板之间存在单碱基的不匹配现象，则该引物难以发生延伸反应，且在与另一个引物之间也难以发生扩增反应。由此，根据通过扩增反应而产生的扩增产物量，能够进行单碱基·的识别。根据该方法，进行扩增反应后，无需进行用于识别单碱基的进一步操作。然而,该方法中，反应容易受到反应条件例如模板量、温度、引物量、或用作反应底物的dNTP浓度等的影响。因此经常获得有再现性的数据并不容易。作为其他方法，例如研究过在引物3’末端附近引入人工变异(与模板不匹配的碱基)的方法(参照非专利文献7)。然而，在该方法中，为了引物的优化也需要付出一定的劳动，且识别精度也受到试样品质的影响。为了解决这些问题，提出了一种使至少两种被荧光色素等标记的引物发生竞争的方法(参照专利文献广4)。如专利文献f 3所记载，被称为等位基因特异性PCR (ASP-PCR)的检测方法是利用下述特性使引物的3’末端或末端附近与需要检测的碱基位置相互补、且与试样中的目标核酸碱基相匹配时发生延伸反应，不匹配时难以发生延伸反应的特性来进行检测。进行等位基因特异性PCR反应时，可知在使两个以上的等位基因特异性引物发生竞争的状态下，其碱基识别精度高于对各个等位基因特异性引物分别进行扩增时的碱基识别精度(非专利文献8)。其原因在于，当存在与需要检测的等位基因不同的等位基因时，与不同的等位基因相匹配的引物优先与目标碱基序列结合，从而抑制了需要检测的引物的非特异性延伸反应。而且，由于与不同的等位基因相匹配的引物进行有效的延伸反应，进而消耗掉延伸反应所需的材料，因此，也能够抑制通过与需要检测的等位基因不匹配的引物所引起的引物二聚体的生成。如此的使引物之间发生竞争的检测方法称为竞争性寡核苷酸引发(COP, Competitive Oligonucleotide Priming),在专利文献 I 4 中米用 COP。专利文献I所提出的方法是利用了当相对于目标核酸使用不匹配碱基数量不同的多个竞争性引物时，不匹配碱基数量少的竞争性引物与目标核酸容易形成双链的性质的方法，该方法是简便地检测出目标核酸中的单碱基变异的好方法。然而，在该方法中，进行SNP解析时有可能发生假阳性反应。其原因认为，由于只针对目标核酸中的单碱基变异而设计竞争性引物，因此，对不匹配碱基数量多的竞争性引物延伸的抑制能力不够充分的缘故。用于等位基因特异性PCR反应的等位基因特异引物中，其与目标核酸在3’末端附近的双链的稳定性非常重要，在3’末端附近，以除了需要识别的碱基以外，其它碱基与目标核酸不形成互补的方式进行设置，能够进一步提高碱基识别能力。在专利文献2的SNP检测方法中，为了减少存在于专利文献I中的假阳性问题，在竞争性引物的3’末端引入用于识别SNP的碱基，而且在3’末端的第2飞个碱基中的至少一个碱基上引入人工变异。另外，由专利文献3所提出的碱基多态检测方法中，在竞争性引物的3’末端第5个碱基上引入人工变异。专利文献2 3所提出的方法是在竞争性引物之间的相同位置上引入相同变异的方法，该方法利用了下述特性如果引物的3’末端附近与目标核酸相匹配，则能够有效地进行延伸反应，不匹配碱基数量越多，延伸效率越低的性质。另外，随着不匹配碱基的增加， 引物与目标核酸之间的双链在整体上变得不稳定，这本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：牧野洋一，山根明男，中山雅人，
申请(专利权)人：凸版印刷株式会社，
类型：
国别省市：