本发明专利技术涉及一种中等长度基因编码序列单核苷酸多态性(cSNP)快速检测试剂盒，属于生物技术领域。具有操作简单、检测速度快、成本低廉的特点。本发明专利技术通过简化非变性聚丙烯酰胺凝胶的制胶、跑胶和染胶的过程，组合优化检测试剂，在保证cSNP判型质量的前提下达到了快速、高效检测的效果：制胶只需20分钟、跑胶只需4-6个小时、染胶和显色只需30分钟。省时省力，特别适用于检测大批量动物组织样本的中等长度基因的cSNP。本发明专利技术所得到的非变性聚丙烯酰胺凝胶图条带清晰，用肉眼即可观察判型，且结果可靠。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种中等长度基因(150-350 bp)编码序列单核苷酸多态性(cSNP)的快速检测试剂盒，属于生物
技术介绍
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)是人类和其它动物基因组中DNA序列上群体发生概率大于1%的单个核苷酸差异。又被称为第三代DNA遗传标记。SNP指在染色体基因组水平上单个核苷酸位置存在转换(C/T互换，在其互补链为G/A互换)、颠换(包括C/A、G/T、C/G和A/T)、插入和缺失等变异引起的序列多态性。SNP在人类基因组内广泛存在，平均每500 1000个碱基对中就有一个。基因组内的任何碱基都存在发生变异的可能，根据SNP所处位置，将SNP划分为三种形式第一种是分布在基因编码序列上的单碱基变异(coding sequence SNP, cSNP);第二种是分布在基因内含子上的单核苷酸突变(intixm SNP, iSNP);第三种是分布在基因外部调控区序列上的SNP (regulatory region SNP, rSNP);第四种是分布在其他区域的SNP。基因内部序列包含编码序列(外显子)和非编码序列(内含子)，编码序列的碱基突变率仅占全部突变的20%，因此位于编码区内的SNP (cSNP)通常较少。但cSNP在遗传疾病研究中具有重要意义，根据其对蛋白质二级结构影响来说，cSNP可分为以下两种 第一种是同义突变(synonymous mutation),即cSNP并不影响基因编码蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的翻译相同。第二种是错意突变(missense mutation),即cSNP导致其翻译的氨基酸发生改变，从而改变其编码蛋白的序列，影响蛋白质功能。错意突变cSNP是导致生物性状改变的关键因素。与第一代遗传标记RFLP和第二代遗传标记微卫星相比，第三代遗传标记SNP具有以下优点二等位性、稳定性高、密度高、作用直接和易于进行自动化分析。SNP分析技术按其研究对象主要分为两大类一是对未知SNP进行分析，即找寻未知的SNP，可用于增加遗传图谱精密度，寻找某一性状的的基因标记。二是对已知SNP进行分析，即对不同群体SNP进行遗传多样性检测，或在临床上对已知致病基因的遗传病进行基因诊断。SNP分析最基本的方法是直接测序法、凝胶电泳法和高通量分析法。直接测序法的优点是方便，且信息丰富；缺点是费用很高，时间较长。凝胶电泳法主要有单链构象多态性(single strandconformationalpolymorphism, SSCP)、限制性片段长度多态性(restriction fragmentlength polymorphism,RFLP)等,优点是成本低廉、结果可靠,所以科研院所中应用普遍；缺点是对未知的SNP基因型判定时，需结合测序结果确定。高通量SNP分型技术包括基因芯片法(Gene chip)、荧光检测法(Taqman)、质谱法(Mass spectrum)和高效液相层析法(high performance liquid chromatographyv,HPLC)等，这些方法优点是可大规模、快速检出SNP，缺点是价格昂贵，且对样品要求较高。目前实验室中应用最广的检测cSNP的技术为SSCP方法，但原有的操作步骤繁琐，花费时间较长，如果检测较多样品时，会耗费大量的人力物力。SSCP主要分为制胶、跑胶和染胶三步操作步骤如下 第一步为制胶(非变性聚丙烯酰胺凝胶工作液制作)，操作步骤如下(I)蒸馏水清洗玻璃板，室温自然晾干，夹紧玻璃板和胶条，避免胶条有缝隙而漏胶。(2)配制非变性聚丙烯酰胺凝胶工作液，混合均匀后迅速灌胶。第二步为跑胶(电泳)，操作步骤如下(I)电泳槽中加满IXTBE电泳液,夹上制好的胶板，预电泳。(2)将上样液(PCR产物和变性Buffer混合物)一定温度下变性10min，迅速冰浴8 min。(3) 110 V电压，电泳10-15 h。 第三步为染胶(非变性聚丙烯酰胺凝胶中DNA的银染)，操作步骤如下(I)电泳完毕后，取下凝胶，并在凝胶上做标记以区分。(2)将凝胶放入一定浓度的乙醇中固定半小时。(3)弃固定液，蒸馏水漂洗2次，弃漂洗液。(4)加入现配染色液，染色40分钟。(5)弃染色液，蒸馏水漂洗3次，弃漂洗液。(6)加入现配显色液，显色至观察到清晰条带。(7)弃显色液，蒸馏水漂洗2次，将胶装入保鲜袋中拍照、保存。
技术实现思路
技术问题 本专利技术所要解决的技术问题是提供一种“傻瓜式”的基因编码序列单核苷酸多态性(cSNP)的快速检测方法，操作简单、所用试剂安全、成本经济、结果可靠，以适应大批量样品基因cSNP的快速检测。技术方案 为解决上述技术问题，本专利技术对SSCP的制胶、跑胶(电泳)和染胶三个阶段进行了全面改进，节约出大量人力和试剂，并且在不降低实验效果的前提下减少试剂种类，制作成cSNP快速检测试剂盒。本专利技术的技术解决方案是 一种中等长度基因编码序列单核苷酸多态性(cSNP)快速检测试剂盒，包括30%丙烯酰胺和10 X TBE和50%甘油的10:3:3混合液(溶液A)、10%过硫酸铵(溶液B)、TEMED (溶液C)、变性Buffer (溶液D)和质量比为O. 1%的硝酸银(溶液E)。上述试剂盒用于检测中等长度基因编码序列单核苷酸多态性(cSNP)快速检测方法为 制胶检测24个样品时，需配制一块含24个点样孔的非变性聚丙烯酰胺凝胶(胶浓度为10%)，需24次的试剂盒用量，配方为A溶液16.0 ml、B溶液210 yl、C溶液20 μ I、去离子水14. O ml。上述为配制一块胶的量，配制多块胶时，按此比例成倍添加试剂即可。灌胶至玻璃板上，室温放置20分钟，待凝胶聚合后，小心拔出24齿梳子(拔出后，会产生24个点样孔)，把此胶板夹到垂直电泳槽上。跑胶向每个样品的PCR产物(4 μ I)中分别加入D溶液6 μ 1，然后对此溶液混合物(上样液)，98 °C变性10分钟，迅速冰浴8分钟。对上样液进行点样，之后预电泳5分钟，再在4 ° C冰柜内用200 V电压，电泳4-6小时。染胶(1)先向搪瓷盘中倒入E溶液I ml，再倒入蒸馏水199 ml (即将E溶液稀释200倍)，摇匀，将胶放入搪瓷盘中，80 rpm摇15分钟(染胶)，再用蒸馏水快速洗胶约5秒钟。(2)然后直接用2%的氢氧化钠于搪瓷盘中冲洗胶5秒钟(需快速晃动搪瓷盘)，再加入新鲜的2%的氢氧化钠显色15分钟左右，用蒸馏水终止显色。有益效果 (I)本专利技术优化了制胶环节，用一种溶液(溶液A)代替了三种溶液，减少了操作步骤，降低了实验误差，将原来的制胶时间I小时缩短至现在的30分钟，节约了 50%的时间。(2)同时优化了跑胶(电泳)环境，将原来的电泳时间12-16小时缩短至现在的4-6小时，节约了 60%的时间。(3)在最后的染胶阶段，本专利技术将原来的7个操作步骤精减至2个，大大降低了劳动强度，将原来的染胶时间2-3小时缩短至现在的O. 5-1小时，节约了 70%的时间。这些使得本试剂盒成本低廉，操作简单、省时省力、结果可靠市场竞争力强。本专利技术方法得到的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图，条带清晰，易于观察(可直接用肉眼观察)。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种中等长度基因编码序列单核苷酸多态性快速检测试剂盒，包括：溶液A：质量比30%的丙烯酰胺、10×TBE和质量比50%的甘油以体积比10:3:3的混合液；溶液B：质量比10%的过硫酸铵；溶液C：TEMED；溶液D：变性Buffer？；和溶液E：质量比为0.1%的硝酸银。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：付言峰，任守文，李兰，李碧侠，王学敏，方晓敏，陈哲，赵芳，涂枫，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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