本发明专利技术公开了一种检测成本低、使用方便、检测快速高效、灵敏度高的基于环介导等温扩增技术的结核分枝杆菌的检测试剂盒，以及在该试剂盒上应用到的引物。所述引物的序列如序列编号SEQ?ID?NO.1～4所示；本发明专利技术所述试剂盒除了包括上述引物外，还包括12.5μl的扩增体系预混合物、1μl?5～15pmol/μl的引物F3、1μl?5～15pmol/μl的引物B3、1μl?20～40pmol/μl的引物FIP、1μl?20～40pmol/μl的引物BIP、2.5μl的无菌双蒸水；利用所述试剂盒进行环介导等温扩增检测结核分枝杆菌，能使检测成本大大降低，且检测快速高效，灵敏度高。本发明专利技术可应用于结核分枝杆菌检测领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及结核分枝杆菌的检测技术，尤其涉及一种环介导等温扩增检测结核分枝杆菌的检测试剂盒及其引物。
技术介绍
结核分枝杆菌(MycobacteriumTuberculosis, TB)简称为结核杆菌(tuberclebacilli)。早在1882年，德国细菌学家郭霍(Robert Koch，1843-19 10)就已证明结核分枝杆菌是结核病的病原菌。结核分枝杆菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降。20世纪80年代后，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困及人口流动等因素，全球范围内结核病的疫情骤然恶化。如今，结核病仍然是影响人类健康流行性最广、病死率最高的感染性疾病之一。寻求快速、准确的诊断方法一直是结核病学首要研究的领域。目前，肺结核的诊断方法主要包括(I)痰涂片检查。一般初次就诊要查三个痰标本，即夜间痰、清晨痰和即时痰。痰涂片检查的阳性率受标本质量、处理方法、观察视野数、镜检者的技术水平和经验等因素的影响。痰涂片镜检法操作简便、出结果快、费用低廉，但只以抗酸性特征为依据，故不能作为结核杆菌种特异性鉴定的依据。(2)痰结核菌培养，结果可信度高，并能做结核菌药敏试验，但需时6-8周，应用受到限制。该法至少需要IO3—IO4细菌/ ml才能检出阳性结果。特别是微量菌、细胞壁缺陷菌和化疗后细菌受到损伤培养难以生长，就更突出了培养的局限性。同时由于肺结核属于呼吸道传播的烈性传染病，对实验室安全要求较高,不利于结核杆菌的普遍筛查。(3)免疫法。此检测技术快速简便、成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。(4)聚合酶链式反应(PCR)。聚合酶链式反应法技术因其灵敏、特异、快速，对于难以培养、生长缓慢的结核分枝杆菌检测有着独特意义，已成功用于临床标本结核分枝杆菌的检测，近年来，该技术在结核分枝杆菌检测中的应用研究取得很大进展，特别是通过与DNA指纹技术、DNA探针技术结合，进一步提高了检测的灵敏度和准确性，不但能定性，而且能定量检测出结核分枝杆菌DNA的含量，该成果将对临床具有极大的意义。由于目前基因检测技术的复杂性和结核分枝杆菌的高传染性，要进行结核分枝杆菌的基因检测，不仅需要昂贵的仪器设备，而且对实验室条件也有很高的要求，这给结核病的快速诊断造成许多困难，不利于基层医疗防疫机构及现场快速测定。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是一种新型核酸扩增技术，最初由日本科学家Notomi，T等设计用来检测病原微生物，具有简单、快速、特异性强的特点。其基本原理是采用4条引物来识别基因上的6个特异区域，同时利用一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在恒温条件下进行扩增反应。将样品、引物、具有链置换特性的DNA聚合酶及反应液混合，置于60 65°C的恒温条件下反应，基因的扩增和检测即可一步完成。该扩增法扩增效率高，15 60分钟内DNA扩增可达IO9 101°倍。鉴于其高特异性，可通过扩增产物是否生成来判断目的基因是否存在。该方法不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，LAMP法具有高特异性、高效性、快速、廉价(不需要特定的贵重检测设备，只需要简单结构的恒温箱)、易检测(直接进行目测判断)等特点。LAMP具有简单、快速、特异性强的特点，能代替PCR方法的最新技术。现已被广泛用于微生物检测及胚胎性别鉴定等领域，如何运用环介导等温扩增技术检测结核分枝杆菌在临床诊断技术发展中具有重大意义，因此开发一种简单快速、检测效率高的运用环介导等温扩增技术来检测结核分枝杆菌的方法迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种检测成本低、使用方便、检测快速高效、灵敏度高的基于环介导等温扩增技术的结核分枝杆菌的检测试剂盒，以及在该试剂盒上应用到的引物。该试剂盒是基于环介导等温扩增技术来检测结核分枝杆菌的。本专利技术环介导等温扩增检测结核分枝杆菌的引物所采用的技术方案是本专利技术所述引物包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP及内引物BIP，其序列分别如下外引物 F3 :5’ -ACCGAGGTCAAATCGITTGT-3’ ；外引物 B3 :5’ -ATCCGTGGAACGGCAATC-3’ ；内引物 FIP :5’ -CGAGGACACAGCCTTGTTCACAGAACAGCTGACCCACTGG-3’ ；内引物 BIP :5’ -CGTATCGCGGCACGTAAGGCGGGCAATCCACCGATGTC-3’。本专利技术环介导等温扩增检测结核分枝杆菌的检测试剂盒所采用的技术方案是本专利技术所述试剂盒包括以下成分权利要求1.一种环介导等温扩增检测结核分枝杆菌的引物，其特征在于，包括外引物F3、外弓丨物B3、内引物FIP及内引物BIP，其序列分别如下外引物 F3 :5’ -ACCGAGGTCAAATCGITTGT-3’ ；外引物 B3 :5’ -ATCCGTGGAACGGCAATC-3’ ；内引物 FIP :5’ -CGAGGACACAGCCTTGTTCACAGAACAGCTGACCCACTGG-3’ ；内引物 BIP :5’ -CGTATCGCGGCACGTAAGGCGGGCAATCCACCGATGTC-3’。2.一种包括如权利要求I所述的环介导等温扩增检测结核分枝杆菌的引物的检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如下成分3.根据权利要求2所述的环介导等温扩增检测结核分枝杆菌的检测试剂盒，其特征在于所述扩增体系预混合物中含有2. 5ul 10倍浓缩的Bst DNA聚合酶反应缓冲液、4ul10mmol/L dNTP、lul 100mmol/L 硫酸镇、5ul 5mol/L 甜菜减。全文摘要本专利技术公开了一种检测成本低、使用方便、检测快速高效、灵敏度高的基于环介导等温扩增技术的结核分枝杆菌的检测试剂盒，以及在该试剂盒上应用到的引物。所述引物的序列如序列编号SEQ ID NO.1～4所示；本专利技术所述试剂盒除了包括上述引物外，还包括12.5μl的扩增体系预混合物、1μl 5～15pmol/μl的引物F3、1μl 5～15pmol/μl的引物B3、1μl 20～40pmol/μl的引物FIP、1μl 20～40pmol/μl的引物BIP、2.5μl的无菌双蒸水；利用所述试剂盒进行环介导等温扩增检测结核分枝杆菌，能使检测成本大大降低，且检测快速高效，灵敏度高。本专利技术可应用于结核分枝杆菌检测领域。文档编号C12N15/11GK102888455SQ20121033962公开日2013年1月23日 申请日期2012年9月14日 优先权日2012年9月14日专利技术者孙宜峰, 龚惠勇, 曾冰冰 申请人:珠海市银科医学工程有限公司本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种环介导等温扩增检测结核分枝杆菌的引物，其特征在于，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP及内引物BIP，其序列分别如下：外引物F3：5’？ACCGAGGTCAAATCGTTTGT？3’；外引物B3：5’？ATCCGTGGAACGGCAATC？3’；内引物FIP：5’？CGAGGACACAGCCTTGTTCACAGAACAGCTGACCCACTGG？3’；内引物BIP：5’？CGTATCGCGGCACGTAAGGCGGGCAATCCACCGATGTC？3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙宜峰，龚惠勇，曾冰冰，
申请(专利权)人：珠海市银科医学工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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