本发明专利技术公开了一种三七快速鉴定方法，其包括如下步骤：1）以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ?ID?No.1所示序列的片段；2）对扩增产物进行测序，分析SEQ?ID?No.1所示的序列，如果自SEQ?ID?No.1所示序列的5’端起第140位为T或207位为T，则鉴定为三七，如果自SEQ?ID?No.1所示序列的5’端起第140位和第207位不是T，则待鉴定样品不是三七。本发明专利技术能够实现三七原植物及其近缘种、药材、生饮片、粉未和混淆品的快速、准确鉴定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术术语中药材来源品种鉴定
，具体涉及用特异的SNP鉴定三七的方法。
技术介绍
三七(Panax notoginseng (Burk. ) F. H. Chen)是人参属多年生植物,是我国传统中药材，含有多种生物活性成分。三七是名贵中药材，具有散瘀止血，消肿定痛之功效。可治疗各种出血症,人参“补气第一”，三七“补血第一”，味同而功亦。三七与人参(Panax ginsengC. A. Mey)、西洋参(Panax quinquefolium L.)、竹节参(Panax japonicus C. A. Mey.)及其变种狭叶竹节参(Panax japonicus C. A. Mey. var. angustifius (Burk) Cheng et Chu)、珠子参(Panax japonicus C. A. Mey. var. major (Burk) C. Y. Wu et Κ. M. Feng)、姜状三七(Panax zingiberensis C. Y. Wu et K.)、屏边三七(Panax stipuleanatus Tsai et Feng)和假人参(Panax pseudoginseng Wall.)均作为药物使用，它们来源于同科、同属，为亲缘关系相近的植物，这几种药物在药性和功效方面有很大区别，尤其是三七归为活血、止血类药物而非滋补性药物，在中医临床上也区别使用。三七药材价格昂贵，市场上常出现其混伪品。由于三七与其近缘种、混伪品外形类似，传统的性状鉴别对三七与其近缘种的鉴定有一定困难，尤其对于药材市场存在的三七切片、粉末、种子和种苗的鉴别具有更大障碍。这就需要寻找到一种稳定可靠的方法将三七药材、饮片、粉末加以鉴定区分。
技术实现思路
本专利技术第一个目的在于提供三七鉴定用SNP标记。本专利技术第二个目的在于提供三七鉴定用SNP标记在三七鉴定中的应用。本专利技术第三个目的在于提供本专利技术提供的三七鉴定用SNP标记，其核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，其中，SEQID No. I所示序列的5’端起第140位三七为T，其他物种为A或缺失；第207位三七为T，其他物种为C或A。本专利技术提供的SNP可用于鉴定三七，如果自SEQ ID No. I所示序列的5’端起第140位为T或第207位为T，则鉴定为三七，如果自SEQ ID No. I所示序列的5’端起第140位和第207位不为T，则待鉴定样品不是三七。本专利技术提供的三七鉴定方法，其包括如下步骤I)以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No. I所示序列的片段；2)对扩增产物进行测序，拼接后去除序列两端5. 8S和26S基因区，获得完整ITS2基因间隔区，通过分析SEQ ID No. I所示的序列，确定自SEQ ID No. I所示序列的5’端起第140位或第207位的碱基。其中，如果自SEQ ID No. I所示序列的5’端起第140位为T或第207位为T，则鉴定为三七，否则不是三七。本专利技术扩增时使用的弓丨物序列为ITS2F 5' -ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'ITS3R 5' -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'上述引物用于扩增三七的ITS2序列。本专利技术还提供含有上述弓I物的试剂盒。本专利技术提供了上述试剂盒在三七鉴定中的应用。本专利技术方法适用性更广，能检测所有能提取出DNA的三七任何样品。因此，能够实现三七原植物与近缘种、药材、生饮片、粉末与混淆品的快速、准确鉴定。 附图说明图I所示为ITS2序列的扩增结果，其中1-11分别代表SN01-SN11的扩增结果，CK为阴性对照。图2所示为三七(P. notoginseng)的三个种内变异类型。图3所示为三七(P. notoginseng)和其他物种ITS2序列的比对结果，其中图3a为ITS2基因间隔区，5’端起第140位，三七为T，其他物种为A或缺失；图3b为在第207位，三七为T，其他物种为C或A。图4所示为三七与混伪品构建NJ树结果。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例I三七药材原料的鉴定方法I)从不同药材商店和道地产地(云南)收集的24份三七样品，分别取20mg药材，在MM400球磨仪(德国Retsch)上进行研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA试剂盒提取总DNA。表I三七样品信息表l-f'J-编 O_§#_购买商I,tT_1soi三七《报)北京好得快药房农大路(I)^2SQ02三七(根)北京好得快药房农大路(2)3SQ03三七(根)北京宏生堂农大路店4SQ04三七(根)北京济安堂五道口店5SQ05三七(根)北京同仁堂百tt店(1)6SQ06三七(根)北京同仁堂北新挢店7SQ07三七(根)北京同仁堂西苑店 8SQ08三七(拫)北京同芝堂东单店9SQC)9三七(根)北京中卫神州大药房10SQlO三七(拫)北京永安堂百萆药店王府弁店11SQll三七(根)云南(道地药tt)12SQ12三七(根)云南(道地药材)13SQ13三七(根)云南(道地药材)14SQ14三七(根)北京同仁堂冒旺店(2)15SQ15三七(根)北京同仁堂北京站店16SQ16三七(根)北京同仁堂崇文门店17SQ17三七《极)北京同仁堂王.府井店18SQiX三七(根)北京京隆堂崇文门店19SQ19三七(振)云南(遁地药紂)20SQ20三七(根)云南(遒地药材)21SQ21三七《根)云南(道地药材)22SQ22三七《拫)云南(道地药材)23SQ23三七(拫)云南(遒地药材)24_SQ24_三七(根)云南(遒地药翁)_2) PCR 扩增引物序列为ITS2F ATGCGATACTTGGTGTGAAT ； ITS3R GACGCTTCTCCAGACTACAAT,由生工生物工程公司有限公司(北京)合成。引物用无菌去离子溶解并稀释至2 μ mol/μ L。25 μ L 反应体系PCR Buffer (IOX) 2· 5 μ L, Mg2+ 2 μ L(25mmol/L)，dNTPs 混合物2μ L (2. 5mmol/L)，引物各 I. O μ L (2· 5 μ mol/L)，模板 DNA I μ L (-约 30ng)，Taq DNA 聚合酶I. OU,加灭菌双蒸水至25 μ L，进行PCR扩增。PCR反应程序在PCR仪上按照以下程序进行扩增反应 94°C, 5 min 940C, 30 s ^56eC, 30 s 40 > 72。。, 45 s-72 eC, 10 miiie分别取5 μ L的PCR扩增产物上样，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后在凝胶成像仪上检测结果。(图I)3)测序PCR产物直接送中国农业科学院重大工程实验室测序。测序引物同本专利技术的ITS2F和ITS3R的PCR引物。为确保DNA条形码序列的可靠性，需要进行正反向测序或重复测序，然后将正反向测序结果进行拼接获得DNA条形码序列。 4)序列拼接本实施例米用应用软件CodonCode Aligner 3.7.1 (CodonCode Co. , Germany)进行序列拼接及校对。首先，进行测序质量评估及预处理，即去除测序结果两端的低质量部分，并对剩余部分进行本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种三七鉴定用SNP标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示，其中，SEQ？ID？No.1所示序列的5’端起第140位为T或第207位为T。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：廖保生，韩建萍，陈晓辰，陈士林，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：
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