一种筛查ALK融合基因的方法技术

本发明专利技术属于医药和生物技术领域，涉及筛查ALK融合基因的方法，尤其是ALK融合基因筛查的多片段引物及其应用。本发明专利技术的筛查ALK融合基因的方法，以样本中的总RNA反转的cDNA为模板，加入加入核苷酸编码序列如SEQ?IDNO?1-14所示的real-time?PCR联合引物，进行实时荧光聚合酶链反应，并通过检测反应产物中反应单位间Ct值的差值检验是否具有ALK融合基因。本发明专利技术方法具有操作简捷，节约时间，结果判断直观、明确，成本较低，污染减少的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药和生物
，涉及ALK融合基因的筛查方法，尤其是ALK融合基因筛查的多片段引物及其应用。
技术介绍
据研究报道，对于非小细胞肺癌(NSCLC)，针对特定的靶点开展个体化治疗已成为现实，例如通过检测表皮生长因子受体(EGFR)基因突变，筛选适合EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)治疗的患者亚群。据美国麻省总医院研究人员发表研究论文称，检测一种间变淋巴瘤激酶(ALK)融合基因如(EML4-ALK)，可对NSCLC患者作进一步细分。ALK融合基因于2007年开始见诸NSCLC相关研究报告。在此之前，研究者已经在多种肿瘤中识别了涉及ALK的基因变异，例如间变性大细胞淋巴瘤、炎性成肌纤维细胞瘤 和成神经细胞瘤等，但不包括肺癌。现有技术公开了 ALK融合基因迄今已发现多种变异类型。分析这些融合基因的结构发现，其ALK部分均包括开始于第20外显子的编码细胞内酪氨酸激酶结构域的基因片段。经检测，所有这些融合基因均有生物学功能，其表达产物为一种嵌合酪氨酸激酶。传统上对ALK融合基因的筛查包括两种主要形式1、普通PCR，通过设计引物，对某一种具体的融合形式进行扩增，根据琼脂糖凝胶电泳判断结果；2、荧光原位杂交(FISH)，通过荧光标记的DNA探针特异性地与肿瘤组织DNA中ALK基因5’端和3’端进行杂交，结果在突光显微镜下判读。对于普通PCR筛查方法，实践显示其具有以下明显缺陷由于ALK融合基因的具体形式众多，所以至少需要设计多对PCR引物，分别进行多次PCR反应，费时费力；并且如果样本是一种新的ALK融合形式(具有未知的“伙伴基因”)，则使用此方法则无法有效地进行检测，而出现假阴性的结果。对于荧光原位杂交(FISH)，虽然目前被认为是诊断融合基因的金标准，但是其价格高昂，实验步骤复杂，对操作人员的技术水平要求极高，致使其亦无法进行推广。因此，目前临床实践中需要提出更加简单、方便、灵敏的ALK融合基因的筛查工具和筛查方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是为克服现有技术所存在的缺陷与不足，提供一种新的筛查ALK融合基因的方法，尤其涉及ALK融合基因的real-time PCR联合引物及其应用。本专利技术提供了筛选ALK融合基因的real-time PCR联合引物。本专利技术的进一步目的是提供上述real-time PCR联合引物在筛查ALK融合基因方法中的应用，本专利技术方法能准确、简捷、经济、直观地判断ALK融合基因存在与否。本专利技术的筛查ALK融合基因方法，以样本中的总RNA反转的cDNA为模板，加入real-time PCR联合引物，进行实时荧光聚合酶链反应，并通过检测反应产物中反应单位间Ct值的差值检验是否具有ALK融合基因。本方法具有操作简捷，节约时间，结果判断直观、明确，成本较低，污染减少的特点。具体而言，本专利技术提供的一种筛选ALK融合基因的方法，其特征在于，其包括如下步骤(I)设计筛查ALK融合基因的7对real-time PCR联合引物或探针；(2)提取样本中的总RNA ；(3)以样本中的总RNA为模板，通过逆转录方法合成cDNA ；(4)在7个real-timePCR反应单位中，以(3)中所得的cDNA为模板，分别加入(I)中设计的7对引物或探针，以及包括荧光染料在内的反应预混液； (5)在real-time PCR反应仪上进行real-time PCR反应,并分别记录每个样本的7个反应单位的荧光阈值(Ct值)；(6)分别计算引物或探针I IV所在反应体系的Ct值的均值Ctiffip，和引物或探针V VII所在反应体系的CT值的均值CtBBP ；(7)计算相对表达量值2_'CT，其中-ACT = -(Ct^p-CtBBp);如2_'CT大于12，则认为该样本具有ALK融合基因。本专利技术中，筛选ALK融合基因的real-time PCR联合引物或探针由7对上游引物、下游引物组成，所述7对引物其核苷酸编码序列如SEQ ID NO 1-14所示，其中第I对SEQID NO 1-2，第 II 对 SEQ ID N03-4，第 III 对 SEQ ID N05-6，第 IV 对 SEQ ID N07-8，第 V 对SEQ ID N09-10，第 VI 对 SEQ ID N011-12，第 VII 对 SEQ ID N013-14。上述引物和探针可以从特定组织中克隆，也可以用化学合成的方法人工合成。本专利技术中，real-time PCR即实时荧光定量聚合酶链反应。聚合酶链反应简称为PCR,其基本原理类似于DNA的天然复制过程。PCR由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成①模板DNA的变性模板DNA经加热使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)模板DNA经加热变性成单链后，温度降低，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸=DNA模板一引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性一退火一延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板，将待扩目的基因不断扩增放大。实时荧光定量PCR，是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。real-time PCR以Ct值为重要的计量单位，反应每个反应单位内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。本专利技术中，反应单位指一个real-time PCR反应单位,例如384孔板或96孔板的一个孔。反应一起可以使用如ABI公司的7900HT Fast、Roche公司的Lightcycler480等。本专利技术中，包括突光染料在内的反应预混液,可以使用商品化产品如Invitrogen公司的 PowerSYBR Green PCR Master Mix、TaKaRa 公司的SYBR Premix DimerEraser 、BIOTIUM公司的Fast Plus EvaGreen qPCR Master Mix ;也可以使用含有类似荧光染料的具有想尽功能的自制预混物。本专利技术中，未及详述的操作均参考冷泉港实验室的《分子克隆》，10-50bp的寡聚核苷酸序列采用人工合成方法，也可以从上海生工公司购买；生物试剂从美国Invitrogen公司或北京天根公司的生物制剂公司购买。本专利技术进行了非小细胞肺癌体外样本的ALK融合基因筛检并验证，结果显示，本专利技术方法的准确性达到100%，敏感性高于普通PCR方法，特异性与金标准FISH相同，通过本方法检测的结果未出现假阳性或假阴性本专利技术的筛查ALK融合基因方法，法以样本中的总RNA反转的cDNA为模板，加入real-time PCR联合引物对，进行实时荧光聚合酶链反应，并通过检测反应产物中反应单位间Ct值的差值检验是否具有ALK融合基因。本方法与现有技术比较，具有操作简捷，节约时间，结果判断直观、明确，成本较低，污染减少的特点。而现有技术中，需经PCR反应、琼本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛查ALK融合基因的方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)设计筛查ALK融合基因的7对real？time？PCR联合引物或探针；(2)提取样本中的总RNA；(3)以样本中的总RNA为模板，通过逆转录方法合成cDNA；(4)在7个real？time？PCR反应单位中，以(3)中所得的cDNA为模板，分别加入(1)中设计的7对引物，以及包括荧光染料在内的反应预混液；(5)在real？time？PCR反应仪上进行real？time？PCR反应，并分别记录每个样本的7个反应单位的荧光阈值Ct值；(6)分别计算引物I～IV所在反应体系的Ct值的均值CtABP，和引物V～VII所在反应体系的CT值的均值CtBBP；(7)计算2？ΔCT，判定样本中是否具有ALK融合基因。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海泉，孙艺华，王瑞，潘云建，胡海川，李晨光，王磊，叶挺，罗晓阳，李航，张扬，
申请(专利权)人：复旦大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：