检测黄牛MEF2C基因SNP位点的RFLP方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测黄牛MEF2C基因SNP位点的RFLP方法及试剂盒，该方法是以黄牛基因组DNA或包含MEF2C基因序列的DNA为模板，进行PCR扩增，然后利用限制性内切酶Hind Ш消化PCR扩增产物，再对酶切后片段进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定黄牛NEF2C基因单核苷酸多态性。由于MEF2C基因在肌肉发育过程中起着重要的调节作用，与黄牛生长和肉质性状密切相关，而且该SNP与黄牛多种重要经济性状相关，所以，本发明专利技术提供的检测方法可用于黄牛肉用生长性状的标记辅助选择，而且该方法操作简单、快速，成本低，检测精确度高，在建立遗传资源优良的黄牛种群方面非常有优势。

【技术实现步骤摘要】
检测黄牛MEF2C基因SNP位点的RFLP方法及试剂盒
本专利技术属于分子遗传学领域，具体涉及基于RFLP(限制性片段长度多态性)的MEF2C(肌细胞增强因子2C)基因单核苷酸多态性(SNP)的快速检测。
技术介绍
所谓单核苷酸多态性(SNP)是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性，包括碱基的插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP是指在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换(以一种嘧啶置换另一种嘧啶或一种嘌呤置换另一种嘌呤)和颠换(嘌呤与嘧啶互换)所引起，其中前者引起的SNPs约占2/3。在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs(cSNPs)、基因周边SNPs(pSNPs)和基因间SNPs(iSNPs)等三类。对于发生在基因编码区的SNPs可以分为同义突变和非同义突变，特别是后者引起的序列改变能使所编码的氨基酸产生变化，进而可能影响合成的蛋白质结构和功能，最终影响个体表型变化。然而，近年来，越来越多的研究表明，分布在非编码区的SNPs可能对基因表达起到重要调控作用，比如内含子一些碱基突变通过改变mRNA剪接位点或存在于内含子中的调节基序来影响转录或翻译。这些SNPs不仅对个体表现型具有重要意义，而且在群体遗传和生物进化研究中也可以作为重要的遗传标记。理论上，在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、直接测序技术和PCR-RFLP等，但SSCP操作繁琐、耗时长，结果易造成误判，而直接测序技术成本又较高。PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。MEF2C是肌细胞增强因子2(myocyteenhancerfactor2，MEF2)转录因子家族一员，最突出的功能是控制肌细胞分化过程中的基因转录，其主要作用是在骨骼肌、心肌和平滑肌的发育过程中介导细胞的分化。在脊椎动物中，MEF2家族由MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D组成，它们在结构上具有同源性，即N端含有高度保守的MADS-box和MEF2结构域，前者提供最小的DNA-binding区域，后者主要功能是有助于提高富含A/T序列的DNA结合的亲和力，并介导MADS—box蛋白质的二聚化，同时也为MEF2与其他辅因子间相互作用提供场所。MEF2C基因位于牛7号染色体上，包括11个外显子和10个内含子，编码367个氨基酸的蛋白质。胚胎发生时期，MEF2C基因在骨骼肌家系和心脏的分化开始时表达，主要作用是维持分化状态，在MEF2家族中第一个表达，后面其它的MEF2基因相继表达。而在成熟组织中，MEF2C基因只在骨骼肌、脾和脑中表达。MEF2C可以激活多种肌肉特异性基因的表达，这些基因对于肌肉组织的分化、维持和再生等有重要作用，因此，MEF2C对于调节肌肉发生和发育具有非常重要的作用。对于黄牛育种来讲，分析MEF2C基因在肌肉发生和发育过程中的调节作用，对于提高黄牛的育肥效率和肉质品质具有重要的理论意义。目前关于MEF2C基因的研究主要集中在小鼠和人心肌和骨骼肌的发生机制上，在畜禽中的相关研究报道还很少，特别在牛上报道更少，且没有相对深入和系统的探索。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测黄牛MEF2C基因SNP位点的RFLP方法及试剂盒，以加快良种选育速度。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：检测黄牛MEF2C基因SNP位点的RFLP方法：包括以下步骤：以黄牛全基因组DNA或包含MEF2C基因序列的DNA为模板，以引物对P为引物，在TaqDNA聚合酶、缓冲环境Buffer、Mg2+和dNTPs存在的情况下，进行PCR扩增，然后利用限制性内切酶HindШ酶切PCR扩增产物，再对酶切后片段进行琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统分析电泳后片段大小，鉴定黄牛MEF2C基因单核苷酸多态性：电泳后片段为224bp时为CC基因型；电泳后片段为224bp、199bp和25bp时为TC基因型；电泳后片段为199bp和25bp时为TT基因型；所述的引物对P为：上游引物F:5′-GATGAACCCCAAACTTAGGCAGAGAAGC-3′(参见SEQ.ID.NO.1)下游引物R：5′-TTCCTAGCAAGGAGCAGATTCACG-3′(参见SEQ.ID.NO.2)所述的PCR扩增的反应体系为：25μL反应体系包括0.5U/μLTaqDNA聚合酶2.0μL(MBI,Fermentas)，10×Buffer2.5μL(MBI,Fermentas)，25mmol/LMgCl21.5μL(MBI,Fermentas)，2.5mmol/LdNTPs2.5μL，50ng/μLDNA模板1.0μL，10μmol/L的上、下游引物各0.25μL和灭菌超纯水15.0μL。所述的PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸20s，33个循环；最后72℃延伸10min。所述的酶切在10μLHindШ酶切体系中进行，HindШ酶切体系包括1.0μL的10×缓冲液，0.5μL的浓度为10U/μL的限制性内切酶HindШ，5μL的PCR扩增产物以及3.5μL的灭菌超纯水，酶切条件为：30℃恒温培养箱中消化5～8h。所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3％。检测黄牛MEF2C基因SNP位点的试剂盒，包括10μmol/L的上、下游引物各0.25μL：上游引物:5′-GATGAACCCCAAACTTAGGCAGAGAAGC-3′(参见SEQ.ID.NO.1)下游引物：5′-TTCCTAGCAAGGAGCAGATTCACG-3′(参见SEQ.ID.NO.2)所述试剂盒还包括0.5U/μLTaqDNA聚合酶2.0μL(MBI,Fermentas)，10×Buffer2.5μL(MBI,Fermentas)，25mmol/LMgCl21.5μL(MBI,Fermentas)，2.5mmol/LdNTPs2.5μL和灭菌超纯水15.0μL。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：MEF2C基因在肌肉发育过程中起着重要的调节作用，与黄牛生长和肉质性状密切相关，本专利技术提供的检测方法为MEF2C基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，可用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)，而且该方法操作简单、快速，成本低，检测精确度高，在建立遗传资源优良的黄牛种群方面非常有优势。附图说明图1为黄牛血液样品基因组DNA电泳检测图。图2为黄牛MEF2C基因内含子4第50位点(IVS4+50T>C)测序图，箭头所示为突变位点。图3为黄牛MEF2C基因PCR产物电泳图。图4为PCR扩增产物Hin本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测黄牛MEF2C基因SNP位点的RFLP方法，其特征在于：包括以下步骤：以黄牛全基因组DNA或包含MEF2C基因序列的DNA为模板，以引物对P为引物，进行PCR扩增，然后利用限制性内切酶HindШ酶切PCR扩增产物，再对酶切后片段进行琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统分析电泳后片段大小，鉴定黄牛MEF2C基因单核苷酸多态性：电泳后片段为224bp时为CC基因型；电泳后片段为224bp、199bp和25bp时为TC基因型；电泳后片段为199bp和25bp时为TT基因型；所述的引物对P为：上游引物:5′‑GATGAACCCCAAACTTAGGCAGAGAAGC‑3′下游引物：5′‑TTCCTAGCAAGGAGCAGATTCACG‑3′。

【技术特征摘要】
1.检测黄牛MEF2C基因SNP位点的RFLP方法，其特征在于：包括以下步骤：以黄牛全基因组DNA或包含MEF2C基因序列的DNA为模板，以引物对P为引物，进行PCR扩增，然后利用限制性内切酶HindШ酶切PCR扩增产物，再对酶切后片段进行琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统分析电泳后片段大小，鉴定黄牛MEF2C基因单核苷酸多态性：电泳后片段为224bp时为CC基因型；电泳后片段为224bp、199bp和25bp时为TC基因型；电泳后片段为199bp和25bp时为TT基因型；所述的引物对P为：上游引物:5′-GATGAACCCCAAACTTAGGCAGAGAAGC-3′下游引物：5′-TTCCTAGCAAGGAGCAGATTCACG-3′。2.根据权利要求1所述检测黄牛MEF2C基因SNP位点的RFLP方法，其特征在于：所述的PCR扩增的反应体系包括0.5U/μLTaqDNA聚合酶2.0μL，10×Buffer2.5μL，25mmol/LMgCl21.5μL，2.5mmol/LdNTPs2.5μL，50ng/μLDNA模板1.0μL，10μmol/L的上、下游引物各0.25μL和灭菌超纯水15.0μL。3.根据权利要求1所述检测黄牛MEF2C基因SNP位点的RFLP方法，其特征在于：所述的P...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈宏，展召阳，张国兴，周雅婷，黄永震，雷初朝，蓝贤勇，胡沈荣，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61