本发明专利技术提供了一种检测MMP-13活性的FRET融合荧光探针，包括通过MMP-13特异性识别降解多肽底物连接的FRET荧光供体蛋白和FRET荧光受体蛋白。本发明专利技术的探针，其利用FRET荧光供体蛋白、FRET荧光受体蛋白分别作为能量共振转移的荧光供体和受体，并通过一段能被待测的MMP-13特异性识别和降解的多肽底物连接，使其能产生能量共振转移现象。在检测的过程中，探针的上述多肽底物被MMP-13特异性识别和降解，那么FRET荧光供体蛋白和FRET荧光受体蛋白之间由于失去连接，产生相互分离，因此导致FRET现象消失，此时根据荧光信号的变化情况，便可以得到待测的样品中MMP-13的含量，从而实现简捷快速和能更加准确地检测MMP-13活性的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白酶生物活性检测
，具体涉及一种检测MMP-13活性的 FRET融合荧光探针。
技术介绍
而在细胞内众多生命活动中，胶原酶-3也即基质金属蛋白酶13 (MMP - 13)在胶 原原纤雏的降解过程中发挥重要作用，明胶酶和间质溶素1主要降解软骨基质中的非腔原 成分。目前研宄认为基质金属蛋白酶13在软骨中表达水平升高是导致骨关节炎关节软骨 退变的主要因素之一。基质金属蛋白酶13 (MMP - 13)所主导的II型胶原的降解和破坏会导 致软骨支架结构的崩塌，软骨细胞赖以发挥功能的结构基础遭到破坏，软骨基质代谢的平 衡破坏进一步加剧，激发进一步的炎症反应和软骨组织破坏，造成炎症与破坏的恶性循环。 因此MMP - 13的浓度变化，活性高低能够及时反应骨关节炎关节软骨退变的进展情况和严 重程度，对其浓度的测定可以更有利地掌握病变进展和施治时机。临床上检测滑膜组织中 MMP - 13的表达有助于指导骨性关节炎的治疗及病情的评估，将MMP - 13和与其他的生物 学指标的检测可以更高效率地确定OA的进展情况，有利于OA的早期诊断和预防。 而在现有滑膜组织中的MMP - 13的表达水平的检测的试剂盒多采用双抗体夹心 法测定。其过程多是用纯化的人基质金属蛋白酶13(MMP-13)抗体包被微孔板，制成固相抗 体，往包被单抗的微孔中依次加入基质金属蛋白酶13 (MMP-13)，再与HRP标记的基质金属 蛋白酶13 (MMP-13)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的 深浅和样品中的基质金属蛋白酶13(MMP-13)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸 光度（0D值），通过标准曲线计算样品中人基质金属蛋白酶13(MMP-13)浓度。 但是上述现有的方法，受限于抗体的特异结合性以及检测灵敏度的限制，且操作 步骤过程繁琐，并且无法检测到活性MMP-13的含量，因此暂无法满足简便、高精度快速检 测的使用需求。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种能够简捷快速和能 更加准确地检测MMP-13活性的FRET融合荧光探针。 为了实现上述专利技术目的，本专利技术实施例的技术方案如下： -种用于检测MMP-13活性的FRET融合荧光探针，包括FRET荧光供体蛋白、FRET 焚光受体蛋白； 所述FRET荧光供体蛋白和FRET荧光受体蛋白之间通过MMP-13特异性识别降解 多肽底物连接。 本专利技术的上述探针，其利用FRET荧光供体蛋白、FRET荧光受体蛋白分别作为能量 共振转移的荧光供体和受体，并通过一段能被待测的MMP-13特异性识别和降解的多肽底 物连接，使其能产生能量共振转移现象。在检测的过程中，探针的上述多肽底物被MMP-13 特异性识别和降解，那么FRET荧光供体蛋白和FRET荧光受体蛋白之间由于失去连接，产生 相互分离，因此导致FRET现象消失，此时根据荧光信号的变化情况，便可以得到待测的样 品中MMP-13的含量，从而实现简捷快速和能更加准确地检测MMP-13活性的目的。 本专利技术进一步还提出一种利用上述FRET融合荧光探针进行MMP-13活性的检测方 法，包括如下步骤： 获取待测蛋白样品； 将所述待测蛋白样品与所述的FRET融合荧光探针进行孵育，并检测荧光信号。 检测的过程中，先将待测蛋白样品与所述的FRET融合荧光探针进行孵育，使探针 的上述多肽底物被MMP-13特异性识别和降解，从而破坏FRET荧光供体蛋白和FRET荧光受 体蛋白之间的能量共振转移现象，使其荧光信号产生变化，通过检测的荧光信号变化的情 况，即可便可以得到待测的样品中MMP-13的含量，从而实现简捷快速和能更加准确地检测 MMP-13活性的目的。 基于上述，本申请进一步提出一种用于编码FRET融合荧光探针的组合氨基酸序 列的DNA和表达该DNA的表达载体，所述DNA具有SEQ. ID. No. 6的核苷酸碱基序列。 本专利技术的通过上述编码FRET融合荧光探针的组合氨基酸序列的DNA，可以进一步 构建表达载体，便可以在大肠杆菌或者其他的等等原核系统大量表达FRET荧光探针，进行 大量的生产。【附图说明】 下面将结合附图及实施例对本专利技术作进一步说明，附图中： 图1为本专利技术实施例用于检测MMP-13活性的FRET融合荧光探针的示意图； 图2为FRET融合荧光探针与MMP-13孵育被降解后导致FRET变化示意图； 图3为FRET融合荧光探针被MMP-13降解前后的SDS-PAGE分析电泳图； 图4为采用FRET融合荧光探针检测标准浓度MMP-13的荧光变化示意图； 图5为采用FRET融合荧光探针检测不同标样浓度MMP-13的荧光变化示意图。【具体实施方式】 为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并 不用于限定本专利技术。 本专利技术实施例提供一种用于检测MMP-13活性的FRET融合荧光探针，可以参见图1 所示；包括FRET荧光供体蛋白10、FRET荧光受体蛋白20、以及连接在FRET荧光供体蛋白 10和FRET荧光受体蛋白20之间的MMP-13特异性识别降解多肽底物30。 本专利技术的上述FRET融合焚光探针基于FRET设计，FRET (fluorescence resonance energy transfer)即焚光能量共振转移，是距离很近的两个焚光分子间产生的一种能量转 移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距 离在IOnm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光 强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。 其基于生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，常利用FRET可以解决超过 光学显微镜分辨率限制的分子相对邻近度问题，来用于监测蛋白质时空动力学，监测二个 蛋白质成份间分子相互作用及检测一个分子内部（如酶活动能力、DNA/RNA形态）的结构 变化等。 本专利技术中设计上述探针，FRET荧光供体蛋白10、FRET荧光受体蛋白20分别作为 能量共振转移的荧光供体和受体，并通过一段能被待测的MMP-13特异性识别和降解的多 肽底物30连接，使其能产生能量共振转移。在检测的过程中，探针的上述多肽底物30被 MMP-13特异性识别和降解，可以参见图2所示，那么FRET荧光供体蛋白和FRET荧光受体蛋 白之间由于失去连接，产生相互分离，因此导致FRET现象极大降低或者消失，导致荧光信 号发生变化从而根据荧光信号的变化情况，便可以得到待测的样品中MMP-13的含量，实现 简捷快速和能更加准确地检测MMP-13活性的目的。 进一步，其中针对待测的MMP-13的酶结合的作用细节，以及对其检测的灵敏度 的。本专利技术中上述能被待测的MMP-13特异性识别和降解的多肽底物30设计，其具有序列 表SEQ. ID. No. 1氨基酸序列多肽序列。从序列表中可以看出，多肽底物的氨基酸序列为 GPLG本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测MMP‑13活性的FRET融合荧光探针，其特征在于，包括FRET荧光供体蛋白、FRET荧光受体蛋白；所述FRET荧光供体蛋白和FRET荧光受体蛋白之间通过MMP‑13特异性识别降解多肽底物连接。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王大平，梁宇杰，段莉，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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