本发明专利技术涉及葛花降糖活性的定量检测方法，可有效解决对葛花降糖活性进行定量检测问题，方法是，包括以下步骤：制备葛花供试药物、配制检测用溶液、制备对照品溶液、测定葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率、效价测定与计算，将葛花供试药物的剂量调整到0.17mg•mL-1~0.68mg•mL-1，对照品的剂量调整为0.0025mg•mL-1~0.0100mg•mL-1，方可进行效价测定，对照品的约定效价值为100U•mg-1，并根据预实验进行葛花的效价估计，本发明专利技术操作简单、快捷，效果好，费用低，基于葛花对α-葡萄糖苷酶活性的抑制，对葛花样品的效价值进行测定及质量控制评价，具有良好的经济和社会效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于中药领域，特别是。
技术介绍
现行中药质量控制方法主要借鉴化学药的质量控制模式与方法，即以定性、定量 测定成分为主。然而中药不同于单一成分的化学药，一般来说中药成分极其复杂，单一成分 难以代表体现中药整体，难以关联中药药效。由此，《中国药典》2010年版编制大纲明确指 出，要建立符合中医药特点的质量标准体系，逐步由单一指标性成分定性定量向活性、有效 成分及生物测定的综合检测过渡，向多成分及和指纹或特征图谱整体质量控制模式转化。 由此而制定的"中药生物活性测定指导原则"已被《中国药典》（一部）2010年版附录收载。 葛花又名葛条花，为豆科植物葛Puerarialobata(Willd. )Ohwi的干燥花蕾。性 凉、味甘，入阳明经。为传统中药，《神经农本草经》、《本草纲目》等记载其具有解酒醒脾、 除烦止渴之功效，主治醉酒、发热烦渴等症。现代研宄葛花所含化学成分非常复杂，有挥发 油类、黄酮类等等，如丁香油酚、芳樟醇、苯甲酸甲酯、丙酸甲酯、异戊酸甲酯、正己酸甲酯、 染料木素、槲皮素、葛花甙、槐花二醇、0 _谷留醇、葛花异黄酮等等，多数成分有明显药理活 性。与葛花同基源(来源于同一植物的不同部位)的另外一种中药葛根被证明具有降低血糖 的药理作用。葛花、葛根均在糖尿病的临床治疗中体现了良好的具有除烦止渴的功效，且基 源相同，但是对于葛花的降糖作用鲜有研宄，更是缺乏相应的生物活性检定方法用于葛花 的质量控制评价。因此，急需建立对葛花降糖活性的定量检测方法。 a -葡萄糖苷酶（a -glucosidase，EC3. 2. 1. 20)又叫a -D-葡萄糖苷水解酶，食 物中的碳水化合物主要成分是淀粉，麦芽糖和蔗糖。淀粉和蔗糖（双糖）均不能直接被肠 壁细胞吸收。唾液和胰a-淀粉酶（a-Amylase)使淀粉水解生成寡糖及二糖，寡糖及二糖 还需要在小肠上皮绒毛膜刷状缘上的a-葡萄糖苷酶的作用下酶解生成单糖(葡萄糖）后 才能被吸收。a-葡萄糖苷酶不仅可以从低聚糖类的非还原末端切开a-1，4糖苷键，释放 出葡萄糖，而且在糖蛋白和糖脂的形成中也有关键的影响。在动物体内，它主要存在于小肠 上半段的刷状缘上它对食物中碳水化合物的消化起着非常重要的作用。a _葡萄糖苷酶抑 制剂是二十世纪八十年代出现的一类新的药物，它通过抑制a -葡萄糖苷酶的活性，延缓 总体碳水化合物的消化时间，从而降低餐后高血糖，防治糖尿病并减少糖尿病并发症。现有 上市的糖尿病治疗药物，如，阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等药物已取得了良好的临床 治疗效果。目前筛选a-葡萄糖苷酶抑制剂主要是根据Piere C等的方法，即以4-硝基 酷-a -D-吡喃葡糖苷（p-Nitrophenol- a -glucopyramoside， PNPG)为底物，在波长400nm(或405nm)处测定在酶作用下释放出的有颜色的物质硝 基酚（PNP)的量，如果反应体系中有影响酶活性的物质，则PNP的量会发生改变，所得吸光 度也会改变，从而测定和计算抑制或促进酶的活性大小，分别可以用抑制率或促进率表示。 对于药品进行质量控制的生物活性测定法又称生物检定（bioassay)，常用于抗生 素、生物制剂的质量控制，它是严格按照药品检定要求设计试验，将药物在体内或体外的生 物反应值经一定统计学处理，用以定性、定量或半定量的表征该药品质量。其中《中国药典》 2010版.二部附录XIV生物检定统计法中规定的"量反应的平行线测定法（2*2)"法、"量 反应的平行线测定法（3*3)"法等便是得到专业认可的药品效价测定方法。该类方法依据 平行线测定原理，即待测样品与对照品在一定条件下的生物活性测定中"量一效关系曲线" 保持平行，再对二者剂量与效应值进行统计学处理，便可得出被测样品的效价值。
技术实现思路
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本专利技术的目的就是提供一种葛花降糖活 性的定量检测方法，可有效解决对葛花降糖活性进行定量检测问题。 本专利技术的技术方案为，包括以下步骤： 1) 葛花供试药物的制备： 将葛花药材净选，粉碎，加入葛花重量8~12倍的双蒸水浸泡25~35分钟，超声提取 15~25分钟，抽滤，得葛花水提物母液，母液质量浓度为0.lg/mL，即为葛花供试药物，密封， 闭光40 °C保存； 2) 检测用溶液的配制： (1) 制备PBS磷酸缓冲液： 将2. 0-2. 5gK2HP04溶解在100mL双蒸水中，制成K2HP04母液；称取3. 2-3. 6gKH2P04 溶解在100mL双蒸水中，制成KH2P04母液；取K2HP04母液30-31ml、KH2P04母液29-31ml，混 匀，得PBS磷酸缓冲液； (2) 制备a-葡萄糖苷酶溶液： 将30U/mg的a-葡萄糖苷酶冻干粉9-llmg溶于28-32ml的PBS磷酸缓冲液中，再加 入55-65mg小牛血清白蛋白，混匀成a-葡萄糖苷酶溶液，4°C保存； (3) 制备PNPG溶液： 将85-95mgPNPG溶于28-32ml双蒸水中，得PNPG溶液； (4) 制备似20)3溶液： 将l〇-llg无水Na2C03溶于90_11〇1111双蒸水中，得似20)3溶液 ； 3) 制备对照品溶液： 取对照品40~60mg，溶于0. 5~1. 5ml双蒸水中，离心，取上清，即得对照品溶液；所述的 对照品为阿卡波糖、伏格列波糖或米格列醇的一种； 4) 测定葛花对a-葡萄糖苷酶活性抑制率： 在样品管中加入葛花供试药物0. 05~0. 2ml和PNPG溶液0. 4~0. 6ml，混匀；在空白管 中加入PBS磷酸缓冲液0. 05~0. 2ml和PNPG溶液0. 4~0. 6ml，混匀；在背景管中加入PBS磷 酸缓冲液〇. 3~0. 4ml、对照品溶液0. 05~0. 2ml和PNPG溶液0. 4~0. 6ml，混匀；然后将上述 溶液在35~40°C保温8~12min，向空白管和样品管中分别加入a-葡萄糖苷酶〇. 2~0. 3ml， 35~40 °C保温18~22min;向空白管、样品管和背景管中加入Na2C03溶液0. 4~0. 6ml，静置 4~6min，从上述管中分别取180~220y1溶液置于96孔板中，在波长400nm处用酶标仪分 别测定各孔板中溶液的吸光度0D值，每管做3个重复，取平均值计算，并将得到的吸光度0D 值代入以下公式计算，得葛花对a_葡萄糖苷酶活性抑制率： 酶活性抑制率=/0D空白组X100% ; 5)效价测定与计算： 将葛花供试药物的剂量、对照品的剂量、葛花对a _葡萄糖苷酶活性抑制率、对照品的 约定效价值、待测样品的估计效价值分别输入中国药典生物检定统计程序BS2000进行计 算，即得葛花样品的效价值，实现葛花质量的评价； 将葛花供试药物的剂量调整到〇. eSmgmr1，对照品的剂量调整为 0.0 C^SmgmL^^O. OlOOmg*!!!!/1，方可进行效价测定，对照品的约定效价值为100U*mg4,并根 据预实验进行葛花的效价估计(说明：1、关于对照品效价的约定：葛花的效价值是通过与 标准品比较而来的，而标准品要经过国家法定部门认定，在国家认定前我们称之为"工作对 照品"，其效价值首次要人为赋予，就像长度本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种葛花降糖活性的定量检测评价方法，其特征在于，包括以下步骤：1）葛花供试药物的制备： 将葛花药材净选，粉碎，加入葛花重量8~12倍的双蒸水浸泡25~35分钟，超声提取15~25分钟，抽滤，得葛花水提物母液，母液质量浓度为0.1g/mL，即为葛花供试药物，密封，闭光40℃保存；2）检测用溶液的配制： （1）制备PBS磷酸缓冲液： 将2.0‑2.5g K2HPO4溶解在100mL双蒸水中，制成K2HPO4母液；称取3.2‑3.6g KH2PO4溶解在100mL双蒸水中，制成KH2PO4母液；取K2HPO4母液30‑31ml、KH2PO4母液29‑31ml，混匀，得PBS磷酸缓冲液；（2）制备α‑葡萄糖苷酶溶液：将30U/mg的α‑葡萄糖苷酶冻干粉9‑11mg溶于28‑32ml的PBS磷酸缓冲液中，再加入55‑65mg小牛血清白蛋白，混匀成α‑葡萄糖苷酶溶液，4℃保存； （3）制备PNPG溶液：将85‑95mg PNPG溶于28‑32ml双蒸水中，得PNPG溶液； （4）制备Na2CO3溶液：将10‑11g无水Na2CO3溶于90‑110ml双蒸水中，得Na2CO3溶液；3）制备对照品溶液： 取对照品40~60mg，溶于0.5~1.5ml双蒸水中，离心，取上清，即得对照品溶液；所述的对照品为阿卡波糖、伏格列波糖或米格列醇的一种；4）测定葛花对α‑葡萄糖苷酶活性抑制率： 在样品管中加入葛花供试药物0.05~0.2ml和PNPG溶液0.4~0.6ml，混匀；在空白管中加入PBS磷酸缓冲液0.05~0.2ml和PNPG溶液0.4~0.6ml，混匀；在背景管中加入PBS磷酸缓冲液0.3~0.4ml、对照品溶液0.05~0.2ml和PNPG溶液0.4~0.6ml，混匀；然后将上述溶液在35~40℃保温8~12min，向空白管和样品管中分别加入α‑葡萄糖苷酶0.2~0.3ml，35~40℃保温 18~22min；向空白管、样品管和背景管中加入Na2CO3溶液0.4~0.6ml，静置4~6min，从上述管中分别取180~220μl 溶液置于96孔板中，在波长400nm处用酶标仪分别测定各孔板中溶液的吸光度OD值，每管做3个重复，取平均值计算，并将得到的吸光度OD值代入以下公式计算，得葛花对α‑葡萄糖苷酶活性抑制率： 酶活性抑制率=[OD空白组‑(OD样品组‑OD背景组)]/OD空白组×100%；5）效价测定与计算：将葛花供试药物的剂量、对照品的剂量、葛花对α‑葡萄糖苷酶活性抑制率、对照品的约定效价值、待测样品的估计效价值分别输入中国药典生物检定统计程序BS2000进行计算，即得葛花样品的效价值，实现葛花质量的评价。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴宿慧，杨宁辉，李寒冰，刘亚敏，李英杰，郭凤鹏，李竹，张颜语，王晨琳，
申请(专利权)人：河南中医学院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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