本发明专利技术公开了一种焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基因的引物对及包含所述引物对的试剂盒，该试剂盒能够一次性检测EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3两种融合基因。通过对EML4-ALK融合基因的mRNA设计引物，经过逆转录PCR后对产物进行测序分析，本试剂盒可以实现EML4-ALK融合基因的快速、准确、高通量的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基 因的引物对，包含所述引物对的试剂盒及该试剂盒的应用。
技术介绍
棘皮动物微管相关类蛋白 4(echinoderm microtubule-associated protein_like4，EML4)与间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK)融合基因 与2007年被日本学者发现存在于部分非小细胞肺癌（NSCLC)患者中，EML4-ALK融合基因在 NSCLC中的阳性率约为3% -4%左右。EML4-ALK融合基因包括多种变异体（variants)，其 中变异体l(variant 1或VI)和变异体3(variant 3或V3)的检出率最高。同时，EML4-ALK 抑制剂为肺癌的个性化治疗提供了新的途径。 当前国内外广泛使用的分子生物学检测EML4-ALK融合基因的方法中，荧光原位 杂交技术（FISH)操作复杂，而且不能区分不同的变异体；荧光定量PCR存在着检测通量 的局限性和假阳性的缺点，所以都还不能真正满足临床诊断检测的需要。传统的固相生物 芯片（Biochip)或基因芯片技术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁琐的突出弱 点。 焦磷酸测序技术（Pyrosequencing)是新一代DNA序列分析技术，具备同时对大量 样品进行测序分析的能力，为高通量、低成本、快速、直观地进行核苷酸分析和临床检验提 供了非常理想的技术操作平台。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的技术问题，本专利技术提出一种焦磷酸测序法检 测EML4-ALK融合基因的引物对以及含有所述引物对的试剂盒，可以同时检测EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3两种融合基因，具有高灵敏度、高特异性、高准确度、检 测迅速等优点。 技术方案：为实现上述技术目的，本专利技术提出了一种焦磷酸测序法检测EML4-ALK 融合基因的引物对，所述的EML4-ALK为EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3中的 任意一种或两种，其特征在于，所述引物对包括： (1)对于 EML4-ALK variant 1 基因， 扩增引物为： 上游引物：5，-CACACCTGGGAAAGGACCTAAA-3，， 下游引物：5，-CGGAGCTTGCTCAGCTTGTACT-3，， 其中下游引物的5'端进行生物素标记； 测序引物为： 5' -TGGGAAAGGACCTAAA-3，； (2)对于 EML4-ALK variant 3 基因： 扩增引物为： 上游引物：5，-TGCAGACAAGCATAAAGATGTCAT-3 '， 下游引物：5，-TTGGGGTTGTAGTCGGTCAT-3'， 其中上游引物的Y端进行生物素标记； 测序引物： 5， -GTGCTTCCGGCGGTA-3'。 本专利技术进一步提出了一种焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基因的试剂盒，所述 的EML4-ALK为EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3中的任意一种或两种，其特征 在于，所述试剂盒包含质控品和如下引物： (1)对于 EML4-ALK variant 1 基因， 扩增引物为： 上游引物：5，-CACACCTGGGAAAGGACCTAAA-3，， 下游引物：5，-CGGAGCTTGCTCAGCTTGTACT-3，， 其中下游引物的5'端进行生物素标记； 测序引物为： 5' -TGGGAAAGGACCTAAA-3，； (2)对于 EML4-ALK variant 3 基因： 扩增引物为： 上游引物：5，-TGCAGACAAGCATAAAGATGTCAT-3 '， 下游引物：5，-TTGGGGTTGTAGTCGGTCAT-3 '， 其中上游引物的5'端进行生物素标记； 测序引物： 5' -GTGCTTCCGGCGGTA-3'。 其中，所述质控品包括阳性对照品和阴性对照品；所述的阳性对照品为含有 EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3的质粒的混合液，所述的阴性对照品为不含 EML4-ALK variant 1 和 EML4-ALK variant 3 的质粒溶液。 本专利技术还提出了上述引物对及包含上述引物对的试剂盒在制备检测EML4-ALK融 合基因的试剂中的应用。 有益效果：与现有技术相比，本专利技术的焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基因的试 剂盒能够实现快速、简便、高效、准确的检测EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3 融合基因，为制备用于检测EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3融合基因的试剂 提供了理论基础。【具体实施方式】 实验材料： 引物由Invitrogen公司合成；Trizol购自Invitrogen公司；逆转录cDNA合成试 剂盒购置于Fermentas公司；多重PCR试剂盒和焦磷酸测序试剂购置于QIAGEN公司。 一种焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基因的试剂盒，所述的EML4-ALK为 EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3中的任意一种或两种，包括质控品和如下引 物： (1)对于 EML4-ALK variant 1 基因， 扩增引物为： 上游引物：5，-CACACCTGGGAAAGGACCTAAA-3，， 下游引物：5' -CGGAGCTTGCTCAGCTTGTACT-3'， 其中下游引物的5'端进行生物素标记； 测序引物为： 5' -TGGGAAAGGACCTAAA-3，； (2)对于 EML4-ALK variant 3 基因： 扩增引物为： 上游引物：5，-TGCAGACAAGCATAAAGATGTCAT-3 '， 下游引物：5，-TTGGGGTTGTAGTCGGTCAT-3 '， 其中上游引物的5'端进行生物素标记； 测序引物： 5' -GTGCTTCCGGCGGTA-3'。 其中，质控品（质控品DNA)包括阳性对照品和阴性对照品；所述的阳性对照品为 含有EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3的质粒的混合液；所述的阴性对照品 作为阴性对照，与阳性对照品相比，阴性对照品为不含EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3的质粒溶液。 检测方法包括如下步骤： ( -）RNA 提取： 取35个NSCLC患者的冰冻组织样本或石蜡包埋组织样本；1-35号患者的临床样 本分别按照下面的步骤提取RNA : (1)将冷冻组织样本在液氮中磨成粉末后，再以每50~IOOmg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10% ; (2)研磨液室温放置5分钟，然后以每1ml Trizol液加入0. 2ml的比例加入氯仿， 盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒； (3)取上层水相于一新的离心管，按每ml Trizol液加 0. 5ml异丙醇的比例加入异 丙醇，室温放置10分钟，4°C下12, OOOg离心1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种焦磷酸测序法检测EML4‑ALK融合基因的引物对，所述的EML4‑ALK为EML4‑ALK variant 1和EML4‑ALK variant 3中的任意一种或两种，其特征在于，所述引物对包括：(1)对于EML4‑ALK variant 1基因，扩增引物为：上游引物：5′‑CACACCTGGGAAAGGACCTAAA‑3′，下游引物：5′‑CGGAGCTTGCTCAGCTTGTACT‑3′，其中下游引物的5′端进行生物素标记；测序引物为：5′‑TGGGAAAGGACCTAAA‑3′；(2)对于EML4‑ALK variant 3基因：扩增引物为：上游引物：5′‑TGCAGACAAGCATAAAGATGTCAT‑3′，下游引物：5′‑TTGGGGTTGTAGTCGGTCAT‑3′，其中上游引物的5′端进行生物素标记；测序引物：5′‑GTGCTTCCGGCGGTA‑3′。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邵棠，陈庆，
申请(专利权)人：邵棠，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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