本发明专利技术公开一种密码子优化型人白介素-17受体(HIL-17RA)与人血清白蛋白(HSA)融合蛋白制备方法及产品。经修饰(密码子优化)的融合基因在原核生物细胞中的表达显著升高。融合蛋白由来自HIL-17RA的多肽片断与人血白蛋白HSA融合而成，优化的HIL-17RA-HSA融合蛋白不仅克服了天然IL-17RA蛋白容易降解的问题，而且具有生物学活性强，蛋白表达量高的特点，本发明专利技术包括这些融合蛋白质的构建，制备和在疾病治疗方面的应用。本发明专利技术在医学和生物制药领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和长效融合蛋白药物
具体而言，本专利技术涉及密码 子优化型的H比-17RA-服A融合基因及其编码蛋白。
技术介绍
白介素17(1111646址111-17，比-17)及其受体（比-17^6。巧1〇'，比-17^)家 族是一类独特的免疫分子-受体家族，在机体自免疫、炎症反应、肿瘤发生及器官移植 反应过程中有重要作用（J.KKolls,A.Linden,Interleukin-ITfamilymembersand inflammation.Immunity21 (4) (2004) 467 ；T.A.Moseley,etal.Interleukin-ITfamily andlX-17receptors.切tokineGrowthFactorRevl4(2)(2003) 15f5)。]X-17A可W刺激多 种组织细胞释放趋化因子，W吸引中性粒细胞到炎症反应区域（M.Laan,etal.Neutrophil recruitmentbyhumanIL-ITviaC-X-Cchemokinereleaseintheairways. J.Immunol. 162(4)(1999) 2347 ；J.Witowski,etal.IL-ITstimulatesintraperitoneal neutrophilinfiltrationthroughthereleaseofGROalphachemokinefrom mesothelialcells.J.Immunol. 165(10) (2000)5814.)为此，利用IL-17A的特异性受体 (比-17RAA)来阻断比-17A的炎症信号传导的炎症反应的是研制治疗溃瘍性结肠炎药物的 热点。由于很多细胞因子类药物的分子量较小，在体内循环时易被肾小球滤过而排出体 夕K药物代谢动力学性质的不佳严重的阻碍了送些细胞因子作为药物的开发前景。蛋白融 合技术是指将另一个蛋白或一个蛋白的结构域融合到基因工程药物上，使得该药物的在 体内作用的半寿期延长。 人血清白蛋白化umanseruma化uminHSA)是血浆中的主要蛋白成分在血 浆中的浓度为 40mg/ml〇%illipP.Min曲ettisetal.，T肥JOURNALOFBIOLOGICAL CHEMISTRY, 1986261:6747-6757)，它除了具有维持血浆渗透压功能外，还能结合内源性和 /或外源性配体，包括激素、有毒代谢产物、药物等。通过结合送些配体，HSA可W调节激素 活性、内源性和1或外源性物质的毒性和药物的利用度Qi-SookHaetal.，Biochimica etBio地ysicaActa, 2003640:119-128)。细胞中刚翻译出来的人血清白蛋白具有典型的 pre-pro-protein结构，包括18个氨基酸残基的信号肤和6个氨基酸残基前肤的原肤。信 号肤和前肤在转运和分泌的过程中被切除，成熟的HSA由585个氨基酸残基组成，含有17 对二硫键，分子量约为66. 5KDa。通常情况下，HSA为非糖基化蛋白。HSA的分子量相对较 大，在正常情况下，不易被肾小球滤过，其血浆半衰期在20天左右。因此WHSA为载体的融 合蛋白技术一白蛋白融合技术（A化umin化Siontechnology)倍受关注。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种经密码子优化的IL-17RA与人血清白蛋白的融合蛋白 的制备方法及产品。本专利技术的融合蛋白在保持了H比-17RA的生理特性的基础上延长其在 体内的半衰期，作为基因工程抗体药物治疗与IL-17信号途经有关的疾病，在药学领域有 良好的应用前景。 本专利技术通过W下技术方案实现上述目的；一种优化的H比-17RA-服A基因，其核巧 酸序列如SEQIDNO: 1所示。具体为密码子优化型人白介素-17受体化IL-17RA)与人血 清白蛋白化SA)通过连接短肤（linker)连接而成，linker的作用是连接两个蛋白，使其空 间构象不发生改变。 本专利技术提供了一种密码子优化型的HIkl7RA-服A融合基因，该融合基因中使用 的密码子为大肠杆菌基因中使用频率最高或次高的密码子。该融合基因能够高表达于大 肠杆菌细胞。本研究对HIkl7RA-HSA基因进行优化的时候兼顾W下几个方面；尽量使用 偏好密码子，W提高mRNA的翻译效率；降低GC含量，调整基因AT含量，防止提前终止；去 除HIkl7RA-HSA基因中影响mRNA有效翻译和稳定性的二级结构；除去使mRNA不稳定和 降解的序列和结构。实验表明优化后的基因在大肠杆菌细胞系中转录水平和翻译水平均高 于其原始基因序列。优化后的H比-17RA-服A基因片段核巧酸序列与原序列比对相似性为 77. 3%，933个氨基酸中有562个氨基酸的密码子得到优化，优化率达到60%。[000引一种H比-17RA-服A的表达载体，该表达载体是由优化的H比-17RA-服A基因插入 到表达载体的多克隆位点构建而成。所述出发载体优选原核表达载体为大肠杆菌表达载体 祀T30a。 本专利技术的优化的H比-17RA-服A基因在制备阻断比-17炎症性通路药物W及融合 蛋白的药物组合物中的应用。【附图说明】 图1显示了优化后H比-17RA-服A基因与优化前的CAI值。 图2显示了优化后H比-17RA-服A基因与优化前的GC含量。 图3显示了本专利技术实施例2所述的T载体质粒图谱。 图4显示了本专利技术实施例2所述的表达载体质粒酶切图谱，1道为祀T30a/ H比-17RA-服A质粒，2道为祀T30a/HIkl7RA-服A质粒经甜al/HimdIII双酶切的产物，M道 为邸ladder。 图5显示了本专利技术实施例3所述的SDS-PAGE电泳图，考马斯亮藍染色。其中，M道 为蛋白marker;NC道为未诱导细胞裂解液；1道为15°C下诱导16小时细胞裂解液；2道为 37C下诱导4小时细胞裂解液； NCi道为未诱导细胞裂解液上清；NCz道为未诱导细胞裂解液沉淀；3道为15C下 诱导16小时细胞裂解液上清；4道为15C下诱导16小时细胞裂解液沉淀；5道为37C下诱 导4小时细胞裂解液上清；6道为37C下诱导4小时细胞裂解液沉淀。 图6显示了本专利技术实施例3所述的融合蛋白检测Westernblot分析，抗His标签 抗体。M道为EasyWesternmarker;1道为15°C下诱导16小时细胞裂解液；2道为37°C下 诱导4小时细胞裂解液；4道为15C下诱导16小时细胞裂解液沉淀；5道为37C下诱导4 小时细胞裂解液上清；6道为37C下诱导4小时细胞裂解液沉淀。 图7显示了本专利技术实施例4HIkl7RA-服A表达的目标蛋白，Ni柱纯化。组分由 SDS-PAGE分析，考马斯亮藍染色。M道为蛋白marker;1道为50mMTris-HCl,SMUrea,P册.0 溶解离必后上清；2道为流出液；3-4道为50mMTris-肥1，8MUrea, 20mM咪哇，P册.O洗脱； 5-7 道为 50mMTris-肥 1，8M化ea，50mM咪哇，抑8.O洗脱；8-11 道为 50mMTris-肥 1，8M Urea, 250mM咪哇，P册.O洗脱。 图8显示了本专利技术实施例4H本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种密码子优化型的HIL‑17RAA‑HSA融合基因，该融合基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张春江，方媛，文娟，陈新君，李晨辉，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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