一种检测融合基因BCR‑ABL(P210）mRNA表达的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种检测融合基因BCR‑ABL（P210） mRNA表达的试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光定量逆转录‑聚合酶链反应（Real‑Time qPCR）技术快速、定量检测融合基因BCR‑ABL（P210） mRNA的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明专利技术的试剂盒实现对外周血或骨髓中融合基因BCR‑ABL（P210） mRNA进行定量检测，检测慢性粒细胞白血病（CML）白血病中融合基因BCR‑ABL（P210）的mRNA表达水平，以有利于诊断、评价患者疗效、预后及对微小残留病变复发的监测。

【技术实现步骤摘要】
一种检测融合基因BCR-ABL(P210）mRNA表达的试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种Real-TimeQ-PCR检测融合基因BCR-ABL(P210）mRNA表达的试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（Real-TimeQ-PCR）技术快速、定量检测融合基因BCR-ABL(P210）mRNA的试剂盒。
技术介绍
慢性粒细胞白血病（ChronicMyeloidLeukemia,CML）是一种起源于造血干细胞的恶性增生性疾病，其细胞遗传学特征表现为具有特异性的费城染色体（Philadephis，Ph）。该特异性费城染色体是由t(9；22)(q34；11)易位形成的。9号染色体原癌基因ABL易位至22号染色体的断裂点簇集区(BCR)，发生重排，产生BCR/ABL融合基因。BCR/ABL融合基因转录为8.5kDa的bcr/abl融合蛋白（P210bcr/abl），该蛋白具有异常增强的酪氨酸激酶（TvrosineKinases，TK）活性，能使造血干细胞发生异常转化而导致CML的突变。根据BCR断裂点位置的不同分为3个主要类型：M-bcr、m-bcr、μ-bcr，分别编码三种蛋白为：p210蛋白、p190蛋白、p230蛋白。其中95%以上的CML患者表达p210蛋白，急性前B细胞白血病具有BCR-ABL融合蛋白阳性患者中有30%以上表达p210蛋白。因此p210蛋白不仅在CML患者中表达，也在急性髓系白血病患者中有表达。目前常用的实验室检测方法主要包括染色体核型分析、FISH、PCR检测等。Real-TimePCR技术是今年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置（CCD）的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。一步法Real-TimeRT-PCR技术是Real-TimePCR的一种（参考文献：YuqiZ,MinY,JohannWMetal.,QuantificationofhumanImmunodeficiencyVirusType1ProviralDNAbyUsingTaqManTechnology,JCliMicrobiol,40（2）：675-678,2002；DrostenC,SeifriedE,RothWKetal.,TaqMan5-nucleasehumanimmunodeficiencyvirustype1PCRassaywithphage-packagedcompetitiveinternalcontrolforhigh-throughputblooddonorscreening,JClinMicrobiol,39:4302-4308,2001；SchuurmanR,DescampsD,WeverlingGJ,etal.,MulticenterComparisonofthreecommercialmethodsforquantificationofhumanimmunodeficiencyvirustype1RNAinplasma.JClinMicrobiol.,34(12):3016-22,1996;ChristophersonC,KidaneY,ConwayB,etal.,PCR-Basedassaytoquantifyhumanimmunodeficiencyvirustype1DNAinperipheralbloodmononuclearcells.JClinMicrobiol.,38(2):630-4,2000.），它是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的Real-TimePCR相比，不同之处在于前者在反应体系中增加了逆转录酶，同时多了一个逆转录反应步骤；相同之处在于两者在反应体系中均有一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针，探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。本试剂盒采用TaqMan荧光探针技术，选取融合基因BCR-ABL(P210）及内参基因ABL为靶区域，分别设计特异性引物及荧光探针，其中荧光探针5’端标记荧光发射基团FAM，3’端标记非荧光淬灭基团BHQ1，利用荧光PCR检测仪可在FAM通道检测荧光信号。由于内参基因ABL在细胞中的表达相对恒定，在本试剂盒中可作为内参对起始细胞量进行校正，用于整个核酸提取和反应体系的质量控制。通过简单易操作的核酸提取系统，结合Real-TimePCR检测系统运行一步法RT-PCR扩增程序，本试剂盒实现了检测的高特异、高灵敏和高效率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种Real-TimeQ-PCR检测融合基因BCR-ABL(P210）的mRNA试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应（一步法Real-TimeQ-PCR）技术快速、定量检测融合基因BCR-ABL(P210）mRNA表达的试剂盒，以实现对外周血或骨髓样本中融合基因BCR-ABL(P210）mRNA进行定量检测，检测慢性粒细胞白血病(CML)等血液系统肿瘤中融合基因BCR-ABL(P210）mRNA的表达水平，以有利于评价患者化疗效果、预后及对微小残留病变复发的监测。为了实现本专利技术，所采取的技术方案为：一种Real-TimeQ-PCR检测融合基因BCR-ABL(P210)mRNA表达的试剂盒，所述试剂盒包括：（1）BCR-ABL(P210)反应液、ABL反应液、一步法PCR酶系、BCR-ABL(P210)阳性定量参考品1-5、ABL阳性定量参考品1-4和阴性对照品，和（2）分隔并集中包装这些试剂管的包装盒；其中，所述BCR-ABL(P210）反应液由正向引物、反向引物、寡核苷酸探针、PCR反应缓冲液等组成；所述BCR-ABL(P210)反应液中正向和反向引物分别是：5’-TCCACAGCATTCCGCTGAC-3’（SEQIDNO:1），5’-CACTCAGACCCTGAGGCTCAAA-3’（SEQIDNO:2）；所述BCR-ABL(P210)反应液中寡核苷酸探针是：5’-X-GCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-Y-3’（SEQIDNO:3），其中X表示的是荧光报告基团，Y表示的是荧光淬灭基团；所述ABL反应液由正向引物、反向引物、寡核苷酸探针、PCR反应缓冲液等组成；ABL反应液中正向和反向引物分别是：5’-GACGTCTGGGCATTTGGAGTA-3’（SEQIDNO:4），5’-TCATACACCTGGGACAGGTCAA-3’（SEQIDNO:5）；以上引物探针浓度均为2~10pmol/人份，优选引物浓度为5pmol/人份、更优选探针浓度为3pmol/人份。所述ABL反应液中寡核苷酸探针是：5’-X-ATGGCATGTCCCCTTACCCGGGA-Y-3’（SEQIDNO本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Real‑Time Q‑PCR检测融合基因BCR‑ABL(P210) mRNA表达的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：（1）RNA提取试剂、BCR‑ABL(P210)反应液、ABL反应液、一步法PCR酶系、BCR‑ABL(P210)阳性定量参考品1‑5、ABL阳性定量参考品1‑4和阴性对照品，和（2）分隔并集中包装这些试剂管的包装盒；其中，所述BCR‑ABL(P210)反应液中正向和反向引物分别是：5’‑TCCACAGCATTCCGCTGAC‑3’（SEQ ID NO:1），5’‑ CACTCAGACCCTGAGGCTCAAA‑3’（SEQ ID NO:2）；所述BCR‑ABL(P210)反应液中寡核苷酸探针是：5’‑X‑GCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT‑Y‑3’ （SEQ ID NO:3），其中X表示的是荧光报告基团，Y表示的是荧光淬灭基团；所述ABL反应液中正向和反向引物分别是：5’‑GACGTCTGGGCATTTGGAGTA‑3’（SEQ ID NO:4），5’‑TCATACACCTGGGACAGGTCAA‑3’（SEQ ID NO:5）所述ABL反应液中寡核苷酸探针是：5’‑X‑ ATGGCATGTCCCCTTACCCGGGA ‑Y‑3’ （SEQ ID NO:6），其中X表示的是荧光报告基团，Y表示的是荧光淬灭基团；所述BCR‑ABL(P210)阳性定量参考品1‑5均为含有BCR‑ABL(P210)目的片段的重组质粒，其浓度为1×10...

【技术特征摘要】
1.一种Real-TimeQ-PCR检测融合基因BCR-ABL(P210)mRNA表达的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：（1）RNA提取试剂、BCR-ABL(P210)反应液、ABL反应液、一步法PCR酶系、BCR-ABL(P210)阳性定量参考品1-5、ABL阳性定量参考品1-4和阴性对照品，和（2）分隔并集中包装这些试剂管的包装盒；其中，所述BCR-ABL(P210)反应液中正向和反向引物分别是：5’-TCCACAGCATTCCGCTGAC-3’（SEQIDNO:1），5’-CACTCAGACCCTGAGGCTCAAA-3’（SEQIDNO:2）；所述BCR-ABL(P210)反应液中寡核苷酸探针是：5’-X-GCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-Y-3’（SEQIDNO:3），其中X表示的是荧光报告基团，Y表示的是荧光淬灭基团；所述ABL反应液中正向和反向引物分别是：5’-GACGTCTGGGCATTTGGAGTA-3’（SEQIDNO:4），5’-TCATACACCTGGGACAGGTCAA-3’（SEQIDNO:5）所述ABL反应液中寡核苷酸探针是：5’-X-ATGGCATGTCCCCTTACCCGGGA-Y-3’（SEQIDNO:6），其中X表示的是荧光报告基团，Y表示的是荧光淬灭基团；所述BCR-ABL(P210)阳性定量参考品1-5均为含有BCR-ABL(P210)目的片段的重组质粒，其浓度为1×103拷贝/5μL～1×107拷贝/5μL；所述ABL阳性定量参考品1-4均为含有ABL目的片段的重组质粒，其浓度为1×103拷贝/5μl～1×106拷贝/5μl。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨子红，秦璐，程春燕，徐伟杰，
申请(专利权)人：广州蓝吉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44