一种基于共线性基因开发标记鉴定大白菜‑结球甘蓝易位系的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于共线性基因开发标记鉴定大白菜‑结球甘蓝易位系的方法，包括：a)确定易位系中结球甘蓝的基因片段区段；获得所述结球甘蓝的基因片段区段及其侧翼区域所有基因序列以及大白菜中对应的共线性基因序列，并根据基因序列的差异位点设计覆盖差异位点区域的引物；b)利用上述引物对易位系亲本大白菜和亲本结球甘蓝进行PCR扩增，根据扩增结果确定结球甘蓝相对于大白菜特异的基因标记；c)利用上述基因标记对易位系亲本大白菜、亲本结球甘蓝和易位系自交后代进行PCR扩增，根据扩增结果获得易位系的鉴定结果。本发明专利技术基于大白菜和结球甘蓝共线性基因序列差异位点设计引物，增加扩增效率的差异，可以直接鉴定外源基因的导入。

【技术实现步骤摘要】
一种基于共线性基因开发标记鉴定大白菜-结球甘蓝易位系的方法
本专利技术属于分子生物学
，尤其涉及一种基于共线性基因开发标记鉴定大白菜-结球甘蓝易位系的方法。
技术介绍
易位系是某物种(供体)的一段染色体和另一物种(受体)的相应染色体片段发生交换后形成的新类型，是作物改良育种的一种手段，可提高作物抗性，增加作物产量和提升作物品质，在作物育种方面具十分重要的意义。在目的基因导入易位系的过程中，对被转移的基因及其染色体片段在受体背景中进行追踪和鉴定，可以提高选择的准确性，缩短育种周期，提高育种效率。因此，对导入易位系中的外源染色体片段进行准确鉴定十分重要。分子标记(Molecularmarkers)，是以个体间遗传物质内核苷酸序列(DNA)变异为基础的遗传标记，在基因型确定、遗传多样性分析、外源片段鉴定、标记辅助育种和系统发育分析等研究中是非常有价值的工具。目前用于鉴定易位系外源片段的方法主要是SSR标记(Simplesequencerepeatmarker)和InDel标记(Insert/deletemarker)。但是由于SSR标记在大白菜和甘蓝间的多态性比率较低，无法用于鉴定大白菜遗传背景中外源甘蓝片段的导入，尽管InDel标记在大白菜-结球甘蓝易位系鉴定中表现了很大优势，但InDel标记无法鉴定具体导入的外源基因和片段在大白菜染色体的的精确位置，以及感兴趣基因是否能够稳定遗传，这为易位系中外源基因的表达和互作研究带来了困难。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于共线性基因开发标记鉴定大白菜-结球甘蓝易位系的方法，本专利技术提供的方法能够鉴定大白菜-结球甘蓝易位系中具体导入的外源基因和片段的精确位置，以及感兴趣基因是否能够稳定遗传。本专利技术的目的是基于白菜和甘蓝共线性基因差异序列开发相对特异的基因标记，为大白菜和结球甘蓝物种鉴别及大白菜-结球甘蓝易位系的精确鉴定提供新方法，为外源甘蓝基因在大白菜遗传背景下的表达、功能研究及利用甘蓝基因改良大白菜遗传背景奠定基础。本专利技术的基本原理是：大白菜与结球甘蓝同属十字花科芸薹属，且都已经完成测序，基于序列的blast发现二者基因组间有较高的同源性，存在很多染色体共线性区段。本专利技术针对大白菜、结球甘蓝共线性基因序列差异位点设计引物，以大白菜、结球甘蓝及其易位系基因组DNA为模板进行PCR扩增，差异位点的不同导致引物的结合效率差异，从而影响PCR扩增效率，通过琼脂糖凝胶电泳检测在供试材料间会表现出PCR产物的有无、带的强弱或位置的差异，若某基因标记在易位系中扩增结果只与大白菜一致，表明该异附加系中没有导入该基因，若某基因标记在易位系中扩增产物只与结球甘蓝一致或同时与大白菜和结球甘蓝相同，表明该易位系中导入了该基因。本专利技术的特点是：基于大白菜和结球甘蓝共线性基因序列差异位点设计引物，增加扩增效率的差异，提高引物多态性，用于大白菜和结球甘蓝物种的鉴别；标记引物在基因内部设计，可以直接鉴定外源基因的导入；共线性基因在大白菜和结球甘蓝中比例较高，可以开发密度高基因标记，更准确鉴定外源染色体片段的大小。本专利技术提供了一种基于共线性基因开发特异标记鉴定大白菜-结球甘蓝易位系的方法，包括：a)确定大白菜-结球甘蓝易位系中结球甘蓝的基因片段区段；获得所述结球甘蓝的基因片段区段及其侧翼区域所有基因序列，以及大白菜中对应的共线性基因序列，并根据基因序列的差异位点设计覆盖差异位点区域的引物；b)利用上述设计的引物分别对易位系亲本大白菜和亲本结球甘蓝进行PCR扩增，根据扩增结果确定结球甘蓝相对于大白菜特异的基因标记，所述基因标记满足以下条件：结球甘蓝有扩增产物而大白菜没有扩增产物；或者二者均有扩增产物，但扩增条带的位置不同；c)利用上述基因标记，分别对易位系亲本大白菜、亲本结球甘蓝和易位系自交后代进行PCR扩增，根据扩增结果获得易位系的鉴定结果。具体而言，本专利技术可以利用InDel标记法确定大白菜-结球甘蓝易位系中结球甘蓝的基因片段区段，然后以该基因片段区段为基础进行后续操作。具体可以包括以下步骤：(1)基因标记引物设计及合成利用大白菜基因组网站(http://brassicadb.org/brad/)数据信息，查找并下载结球甘蓝与大白菜共线性基因序列，通过序列针对差异位点设计引物，由上海生物工程技术有限公司合成。(2)多态性引物筛选采用改良CTAB法提取大白菜和结球甘蓝的基因组DNA，以其为模板，利用设计的基因引物进行PCR扩增，采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，确定设计的基因引物的可用性和多态性。(3)结球甘蓝相对于大白菜特异的基因标记的确定根据琼脂糖凝胶电泳检测结果，统计设计的引物在大白菜‘85-1’和结球甘蓝‘11-1’基因组中的多态性情况，并筛选在‘85-1’中没有扩增产物、而‘11-1’中有扩增产物，或在二者中都有扩增产物但在甘蓝中扩增产物的位置不同于大白菜的引物，作为结球甘蓝相对于大白菜特异的基因标记引物。(4)大白菜-结球甘蓝易位系的鉴定利用筛选确定的结球甘蓝相对于大白菜特异的基因标记，以易位系自交后代为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，揭示大白菜-结球甘蓝易位系易位片段的大小及易位片段在后代中的遗传情况，鉴定大白菜-结球甘蓝易位系。(5)多态性标记在大白菜和结球甘蓝基因组鉴别中的通用性验证利用筛选确定的大白菜‘85-1’和结球甘蓝‘11-1’之间的多态性基因标记，以4个大白菜品种和4个结球甘蓝品种的基因组DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，验证开发的基因标记的实用性。具体的，本专利技术详述为：(1)根据InDel标记鉴定初步确定的外源片段所在结球甘蓝染色体上的位置，从大白菜基因组网站(http://brassicadb.org/brad/)上利用Search工具查找结球甘蓝该段染色体位置及其侧翼所有的基因，及与之对应的大白菜共线性基因，下载其核苷酸序列，利用DNAMEN软件比对共线性基因核苷酸序列差异位点，利用primerpremier5.0软件设计引物，引物覆盖差异位点，所设计引物由上海生物工程技术有限公司合成。(2)将易位系两个二倍体亲本大白菜‘85-1’和结球甘蓝‘11-1’材料种子播种育苗，待幼苗长到3～4片真叶时，剪取新鲜嫩叶，采用改良CTAB法提取基因组DNA，以‘85-1’和‘11-1’基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应总体系20μL，包含10×PCRBuffer(含Mg2+)2μl，2.5mmol/LdNTPs1.6μL，1UTaqase0.2μL，50ng/μLForwardprimer1μL，50ng/μLReverseprimer1μL，50ng/μL模板DNA1μL，灭菌双蒸水13.2μL；PCR扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性3s，57℃退火30s，72℃延伸1.5min，共计35个循环，72℃延伸10min，4℃保温。根据引物不同对退火温度略进行调整。PCR扩增产物采用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳条件为5V/cm恒压，1×TBE电泳缓冲液，上样量5μLPCR产物，1×溴酚蓝上样缓冲液，电泳时间40min左右。(3)根据琼脂糖凝胶电泳检测结果，分别统计设计的引物在大白菜‘本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于共线性基因开发标记鉴定大白菜‑结球甘蓝易位系的方法，其特征在于，包括：a)确定大白菜‑结球甘蓝易位系中结球甘蓝的基因片段区段；获得所述结球甘蓝的基因片段区段及其侧翼区域所有基因序列，以及大白菜中对应的共线性基因序列，并根据共线性基因序列的差异位点设计覆盖差异位点区域的引物；b)利用上述设计的引物分别对易位系亲本大白菜和亲本结球甘蓝进行PCR扩增，根据扩增结果确定结球甘蓝相对于大白菜特异的基因标记，所述基因标记满足以下条件：结球甘蓝有扩增产物但大白菜没有扩增产物；或者二者均有扩增产物，但扩增条带的位置不同；c)利用上述基因标记，分别对易位系亲本大白菜、亲本结球甘蓝和易位系自交后代进行PCR扩增，根据扩增结果获得易位系的鉴定结果。

【技术特征摘要】
1.一种基于共线性基因开发标记鉴定大白菜-结球甘蓝易位系的方法，其特征在于，包括：a)确定大白菜-结球甘蓝易位系中结球甘蓝的基因片段区段；获得所述结球甘蓝的基因片段区段及其侧翼区域所有基因序列，以及大白菜中对应的共线性基因序列，并根据共线性基因序列的差异位点设计覆盖差异位点区域的引物；b)利用上述设计的引物分别对易位系亲本大白菜和亲本结球甘蓝进行PCR扩增，根据扩增结果确定结球甘蓝相对于大白菜特异的基因标记，所述基因标记满足以下条件：结球甘蓝有扩增产物但大白菜没有扩增产物；或者二者均有扩增产物，但扩增条带的位置不同；c)利用上述基因标记，分别对易位系亲本大白菜、亲本结球甘蓝和易位系自交后代进行PCR扩增，根据扩增结果获得易位系的鉴定结果。2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤a)中，利用InDel标记法确定大白菜-结球甘蓝易位系中结球甘蓝的基因片段区段。3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述大白菜-结球甘蓝易位系为大白菜-结球甘蓝易位系。4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤b)中，所述PCR扩增的条件为：PCR反应总体系20μL，包含10×PCRBuffer(含Mg2+)2μL，2.5mmol/LdNTPs1.6μL，1UTaqase0.2μL，50ng/μLF...

【专利技术属性】
技术研发人员：轩淑欣，苏建辉，申书兴，赵建军，王彦华，马聪，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北,13