一种检测Ph‑like相关基因融合位点的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测Ph‑like相关融合基因位点的方法，包括S1：获取骨髓标本，所述骨髓标本来自于患有ALL疾病的人体；S2：从所述骨髓标本中提取基因组RNA；S3：将所述基因组RNA进行逆转录成cDNA；S4：使用特异性扩增引物通过PCR扩增所述基因组cDNA，从而获得PCR扩增产物；S5：对所述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，看是否有对应的融合基因大小的目的的条带；S6：对所述PCR扩增产物进行酶解消化，以便获得酶解消化产物；S7：对所述酶解消化产物进行第一测序反应，以便进行验证。本发明专利技术采用的RT‑PCR方法从实用的角度选择了ABL类的融合基因，用传统的RT‑PCR的方法进行检测。该方法简便快速，成本低。

A method for detecting Ph fusion gene loci related like

The invention discloses a method for detection of Ph like, fusion gene loci including S1: obtained bone marrow specimens, the bone marrow specimens from patients with ALL disease of the human body; S2: genomic RNA was extracted from the bone marrow specimen; S3: the genomic RNA was transcribed into cDNA; S4: the use of specific primers of the cDNA genome was amplified by PCR to obtain the PCR product; S5: the PCR amplified products were analyzed by agarose gel electrophoresis, bands to see whether there is corresponding to the size of the fusion gene; S6: the PCR amplified products were digested, in order to obtain enzyme digestion products; S7: the enzyme digestion products were sequenced to verify the first reaction. RT PCR method provided by the invention, the choice of class ABL fusion gene from a practical point of view, was detected by the traditional method of RT PCR. The method is simple, fast and low cost.

【技术实现步骤摘要】
一种检测Ph-like相关基因融合位点的方法
本专利技术属于生物技术和生物信息学领域，具体地，涉及一种Ph-like相关检验融合基因的方法。
技术介绍
Ph染色体是由人类9号和22号染色体的异位产生的,染色体异位的结果是BCR/ABL融合基因的出现。Ph染色体阳性(Ph+)的急性淋巴细胞性白血病(AcuteLymphoblasticLeukemia,ALL)约占成人ALL的20-25％,占儿童及青少年ALL的3-7。Ph阳性急性淋巴细胞白血病(Ph+ALL)患者接受标准化疗方案后完全缓解率(Completeremission,CR)较Ph染色体阴性ALL患者低,且其持续缓解的时间较短,平均8个月,因此预后较差。在伊马替尼问世前,单接受化疗的Ph+ALL患者,其3年总生存率小于20％,而行异基因造血干细胞移植(allogeneichematopoieticstemcelltransplantation,allo-HSCT)可使3年总生存率达36-44％。酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosinekinaseinhibitor,TKl)伊马替尼联合化疗使得此类白血病的预后大大改善,表现为完全缓解率大大提高,可达90％以上；长期生存率也有一定程度的提高。最新的长期随访数据显示,基于伊马替尼的治疗在4年总生存率上较经典的无伊马替尼治疗方案LALA-94从20％提高到52％。尽管如此,allo-HSCT依然是伊马替尼时代Ph+ALL不可替代的、最重要的根治手段。釆用伊马替尼联合化疗诱导巩固治疗,并在CR1期尽早行allo-HSCT是当前治疗年轻Ph+ALL患者的标准方案。法国一项长期随访结果再次强化了这个观点,在联合伊马替尼的巩固化疗方案基础上,接受过allo-HSCT的患者4年，总生存率达50％,而未行移植患者仅33％。德国、日本及英美的数据显示,基于伊马替尼的诱导化疗加上清髓性allo-HSCT,3年OS率可达到59％-72％；单使用基于TKI的诱导化疗,后续不行allo-HSCT,在长期生存上并无优势。尽管移植在治愈白血病上不可替代,但移植后面临着较高的复发及移植相关死亡的风险,使得移植的疗效受到考量。因此,寻找和识别影响移植疗效的危险因素,对合适的人群行allo-HSCT具有重要的意义。Ph-likeALL是一类BCR/ABL基因融合阴性的，但是基因的表达与ph阳性的ALL相似的一类ALL。近来的基因分析发现Ph-likeALL患者中的一些基因如ABL1，ABL2和其他基因的融合导致了酪氨酸激酶的持续激活。而且当与其他标准风险的ALL患者相比，BCR/ABL基因融合阳性的和Ph-likeALL患者有同样差的预后。由于这两种ALL的分子发病机制是类似的，因此，可以假定BCR/ABL基因融合阳性的ALL患者的治疗方案是可以转移到Ph-likeALL患者中的。K.G.Roberts等在2014年发表的文献TargetableKinase-ActivatingLesionsinPh-likeAcuteLymphoblasticLeukemia中指出，Ph-likeALL患者中有ABL类融合基因存在，可以用酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼进行治疗。
技术实现思路
本专利技术旨在解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本专利技术的一个目的在于提供了一种检测Ph-like相关基因融合位点的方法，选择了ABL类的融合基因，用传统的RT-PCR的方法进行检测。该方法简便快速，成本低。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种检测Ph-like相关基因融合位点的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括：S1：获取骨髓标本，所述骨髓标本来自于患有ALL疾病的人体；S2：从所述骨髓标本中提取基因组RNA；S3：将所述基因组RNA进行逆转录成cDNA；S4：使用特异性扩增引物通过多重PCR扩增所述基因组cDNA，从而获得PCR扩增产物；S5:对所述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，看是否有对应的融合基因大小的目的的条带；S6：对所述PCR扩增产物进行酶解消化，以便获得酶解消化产物；S7：对所述酶解消化产物进行第一测序反应，以便进行验证。根据本专利技术的一个实施例，所述特异性扩增引物是核苷酸序列为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23中的至少一种。根据本专利技术的一个实施例，所述RNA的浓度为160ng/uL-260ng/uL。根据本专利技术的一个实施例，所述融合基因是针对以下多种可以自由组合的融合基因：ETV6(5)，NUP214(34)，ABL1(3)，NUP214(32)，ABL1(2)，ABL1(4)，SNX2(3)，RANBP2(18)，ZMIZ1(18)，RCSD1(3)，ABL2(4)，ZMIZ1(14)，ZEB2(9)，PDGFRB(9)，TNIP1(14)，PDGFRB(11)，EBF1(14)，EBF1(11)，EBF1(15)，SSBP2(16)，CSF1R(12)，SSBP2(6)，ZC3HAV1(12)，PAG1(8)，ABL2(6)，RCSD1(3)。根据本专利技术的一个实施例，按照20μL反应体系计算，所述步骤S4中PCR扩增的反应体系为：试剂体积GoTaqGreenMasterMix10μLddH2O7μLPrimers(5μMeach)1.5μLcDNA1.5μL总体积20μL所述PCR扩增的反应程序为：根据本专利技术的一个实施例，所述步骤S6中所述酶解消化中使用的酶为TAKARA的AlkalinePhosphatase(Shrimp)和ExonucleaseI。根据本专利技术的一个实施例，步骤S7中还包括将测序反应产物进行乙醇沉淀纯化步骤。根据本专利技术的一个实施例，所述琼脂糖凝胶电泳是用北京鼎国昌盛DG-600C电泳仪进行电泳，上海天能1600数码凝胶图像分析系统进行拍照成像。本专利技术采用的RT-PCR方法从实用的角度选择了ABL类的融合基因，用传统的RT-PCR的方法进行检测。该方法简便快速，成本低。一个标本从到实验室到报告的发出总共只需要一天左右的时间，同时成本也大幅度降低，只需要几十块钱。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明图1为根据本专利技术实施例1扩增得到8个多重PCR反应扩增后的产物的2％凝胶电泳图图2为根据本专利技术实施例2扩增得到8个多重PCR反应扩增后的产物的2％凝胶电泳图图3为根据本专利技术实施例3扩增得到8个多重PCR反应扩增后的产物的2％凝胶电泳图图4为根据本专利技术实施例4扩增得到8个多重PCR反应扩增后的产物的2％凝胶电泳图图5为Sanger测序验证从开始一直到214的区域为NUP124exon32与A本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测Ph‑like相关基因融合位点的方法，其特征在于，包括S1：获取骨髓标本，所述骨髓标本来自于患有ALL疾病的人体；S2：从所述骨髓标本中提取基因组RNA；S3：将所述基因组RNA进行逆转录成cDNA；S4：使用特异性扩增引物通过多重PCR扩增所述基因组cDNA，从而获得PCR扩增产物；S5：对所述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，看是否有对应的融合基因大小的目的的条带；S6：对所述PCR扩增产物进行酶解消化，以便获得酶解消化产物；S7：对所述酶解消化产物进行第一测序反应，以便进行验证。

【技术特征摘要】
1.一种检测Ph-like相关基因融合位点的方法，其特征在于，包括S1：获取骨髓标本，所述骨髓标本来自于患有ALL疾病的人体；S2：从所述骨髓标本中提取基因组RNA；S3：将所述基因组RNA进行逆转录成cDNA；S4：使用特异性扩增引物通过多重PCR扩增所述基因组cDNA，从而获得PCR扩增产物；S5：对所述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，看是否有对应的融合基因大小的目的的条带；S6：对所述PCR扩增产物进行酶解消化，以便获得酶解消化产物；S7：对所述酶解消化产物进行第一测序反应，以便进行验证。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特异性扩增引物是核苷酸序列为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23中的至少一种。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA的浓度为160ng/uL-260ng/uL。4.根据权利要求1所述的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐海霞，孙黎，李小青，
申请(专利权)人：武汉康圣达医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42