本发明专利技术公开了一种心脑血管疾病生物标志物的联合检测方法及其诊断试剂盒，联合并行检测方法的特征是能够一次性检测同一个样品中的多种生物标志物，即通过液相芯片的制备，形成“信号标记的检测抗体-心脑血管疾病生物标志物-捕获抗体-微球”的四联复合体，通过检测四联复合体中不同微球的标记信号，从而确定待检测样品中各种不同的心脑血管疾病生物标志物的存在及含量。本发明专利技术还公开了该诊断试剂盒的组成成分及该诊断试剂盒的应用。本发明专利技术所述的方法及试剂盒具有高通量性、高灵敏度和特异性、检测快速准确等突出优点，能够对心脑血管疾病的多种生物标志物同时进行定性和定量检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种体外诊断检测方法及其诊断试剂盒，特别是涉及心脑血管疾病生 物标志物的液相芯片联合并行检测方法及其诊断试剂盒。
技术介绍
心脑血管疾病是中国城市人口和西方发达国家的主要疾病和主要死亡原因之一， 主要包括以冠心病、高血压等为代表的心血管疾病，以及缺血性脑血管病和出血性脑血管 病。缺血性脑血管病，又称急性缺血性脑血管综合症(AICS)，包括脑梗死(Cl)和短暂性脑 缺血性发作(TIA)；出血性脑血管病包括脑出血和蛛网膜下腔出血。心脑血管疾病生物标 志物的联合检测已成为心脑血管疾病的危险因素筛查或预测、早期诊断、疾病进程、疗效监 测和预后判断的非常重要的指标，而多指标联合并行检测的高通量迅速性、准确性和稳定 性就更加至关重要。血清淀粉样蛋白A(SAA)是一种比较敏感的炎症标志物，是预测心血管疾病的独 立指标。白介素_6(IL-6)是一种具有多种效能的细胞炎症因子，是心脑血管的重要的独立 预测因子。近年来研究发现的与心脑血管疾病的发生发展相关的生物标志物还包括可溶 性E-选择素(sE-Selectin)，可溶性细胞间粘附分子(sICAM-1)，可溶性CD40L (sCD40L)，肿 瘤坏死因子-a (TNFa )。目前，对于心脑血管疾病生物标志物的测定已有多种检测方法，包括免疫比浊分 析、酶联免疫分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、磁分离酶联免疫分析(EIMA)等。但是这 些技术都存在着检测通量的局限性，且操作繁琐、灵敏度较差，不能真正满足临床诊断检测 的需要。而固相生物芯片技术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁琐的缺点。液相芯片(χΜΑΡ)又称液态芯片，是一种可广泛应用于蛋白质、基因、受体/配体等 多种生物反应的新一代生物芯片技术，主要包括颜色编码的微球(Color-coded Beads)、探 针分子、被检测物和报告分子四种成分。在微球的制造过程当中，掺入了两种不同的红色分 类荧光，根据这两种荧光的比例不同，把球形基质分为100种，可以标记上100种不同的探 针分子，能同时对一个样品中多达100种不同的目标分子进行检测。反应过程中，探针和报 告分子都分别与目标分子特异性结合。反应结束后，使单个的微球通过检测通道，使用红、 绿双色激光同时对微球上的红色分类荧光和报告分子上的绿色报告荧光进行检测，可确定 所结合的检测物的种类和数量。本专利技术基于液相芯片技术的极高通量性、高灵敏度、高特异性、重复性好、操作简 便、线性范围宽、检测迅速等突出优点，对心脑血管疾病相关的多种生物标志物进行并行检 测，能够在临床检测上得到更好的应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题之一是提供一种用于心脑血管疾病生物标志物的液 相芯片联合并行检测方法；本专利技术所要解决的技术问题之二是提供一种检测心脑血管疾病的多种生物标志 物的诊断试剂盒；本专利技术所要解 决的技术问题之三是提供上述诊断试剂盒的应用。为解决上述技术问题，本专利技术的一种心脑血管疾病生物标志物的液相芯片联合并 行检测方法，包括以下步骤(1)将捕获抗体与不同编号的微球(Beads)偶联，形成“捕获抗体-微球” 二联复 合体，所述的每一种捕获抗体分别抗一种心脑血管疾病生物标志物，从而使待测样品中的 心脑血管疾病生物标志物与捕获抗体形成“心脑血管疾病生物标志物_捕获抗体_微球” 三联复合体；所述的心脑血管疾病生物标志物包含以下标志物的任意一种或任意多种或加 上其它标志物的组合SAA、sE-Selectin、sICAM-1、sCD40L、IL_6、TNFa ；即所述的多种生 物标志物可以是包含SAA、sE-Selectin、sICAM-1、sCD40L、IL-6、TNF δ中任意一种、任意两 种、任意三种、任意四种、任意五种、任意六种或加上其它标志物的组合。(2)将不同的检测抗体进行信号标记，其中所述的每一种检测抗体分别抗一种心 脑血管疾病生物标志物且对应于捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该标志物的不同抗原 表位；(3)将步骤(1)形成的三联复合体与步骤(2)中带有信号标记的检测抗体混合，从 而形成“信号标记的检测抗体_心脑血管疾病生物标志物_捕获抗体_微球”四联复合体；(4)用液相芯片法(χΜΑΡ)检测出四联复合体中不同微球的标记信号，从而确定待 检测样品中各种心脑血管疾病生物标志物的存在及含量。步骤(4)中，所述确定待检测样品中各种心脑血管疾病生物标志物的含量，其具 体方法为将步骤(4)中测定的可检测标记信号与标准曲线进行比较，从而确定待检测样 品中各种心脑血管疾病生物标志物的含量。所述的微球的平均直径可以为5.6 μ m，该微球是结合了不同荧光染料的聚苯烯微 球，即颜色编码微球(Color-coded Beads)。所述信号标记指可采用生物素(Biotin)-链霉亲和素-藻红蛋白 (Streptavidin-PE)的标记或其它本领域常规的免疫标记方法如荧光素、酶、化学发光剂寸。步骤(1)中所述的与捕获抗体偶联的微球，可以使用已经活化的微球(Activated Beads)，能够直接和捕获抗体共价偶联(如通过抗体表面的自由thoil基团)；如果使用羧 基(-C00H)微球，必须先对微球进行活化，通常是采用EDC/S-NHS等化学物质活化，这样微 球就能够被含有自由氨基团(Amino Group)的分子(如抗体等)共价结合。微球活化一般 可采用如下方法微球在由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC) 溶液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(S-NHS)溶液和活化缓冲液组成的3者混合液中进行活化， 其中，3者混合液的用量比是当微球数量为2. 5 X IO6个时，需要50mg/mlEDC溶液10 μ 1 : 50mg/mlS-NHS溶液10 μ 1 =IOOmM NaH2P04、pH6. 3的活化缓冲液80 μ 1，混合液的用量可以 根据微球的数量进行相应的调整。所述的捕获抗体和检测抗体是针对以下6种可以自由组合的心脑血管疾病生物 标志物的捕获抗体和检测抗体SAA、sE-Selectin、sICAM-1、sCD40L、IL_6、TNFa。检测方法中所述的步骤(4)中用液相芯片法(xMAP)进行检测，所述的可检测标记信号是荧光信号。在本专利技术的另一方面，提供一种检测心脑血管疾病生物标志物的诊断试剂盒，主 要包括以下组分(1)偶联抗体的微球含有分别偶联了不同捕获抗体的微球，包含以下任意一种 或任意多种微球偶联了血清淀粉样蛋白A SAA捕获抗体的微球，偶联了可溶性E-选择素 sE-Selectin捕获抗体的微球，偶联了可溶性细胞粘附分子sICAM_l捕获抗体的微球，偶联 了可溶性CD40L SCD40L捕获抗体的微球，偶联了白介素-6IL-6捕获抗体的微球，偶联了肿 瘤坏死因子α TNFa捕获抗体的微球；每种捕获抗体分别抗一种冠心病相关的蛋白标志物 并且偶联于不同编号的微球，形成“抗体_微球”的二联复合体；(2)信号标记的检测抗体包含以下任意一种或任意多种带有信号标记的检测抗 体标记的SAA检测抗体，标记的sE-Selectin检测抗体，标记的sICAM-Ι检测抗体，标记的 SCD40L检测抗体，标记的IL-6检测抗体，标记的TNF α检测抗体本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种心脑血管疾病生物标志物的联合并行检测方法，其特征在于，包括以下主要步骤：（１）将捕获抗体与不同编号的微球Ｂｅａｄｓ偶联，形成“捕获抗体－微球”二联复合体，所述的每一种捕获抗体分别抗一种心脑血管疾病生物标志物，从而使待测样品中的心脑血管疾病生物标志物与捕获抗体形成“心脑血管疾病生物标志物－捕获抗体－微球”三联复合体；所述的心脑血管疾病生物标志物包含以下标志物的任意一种或任意多种或加上其它标志物的组合：血清淀粉样蛋白Ａ ＳＡＡ、可溶性Ｅ－选择素ｓＥ－Ｓｅｌｅｃｔｉｎ、可溶性细胞间粘附分子ｓＩＣＡＭ－１、可溶性ＣＤ４０Ｌ ｓＣＤ４０Ｌ、白介素－６ＩＬ－６、肿瘤坏死因子－αＴＮＦα；（２）将不同的检测抗体进行信号标记，其中所述的每一种检测抗体分别抗一种心脑血管疾病生物标志物且对应于捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该生物标志物的不同抗原表位；（３）将步骤（１）形成的三联复合体与步骤（２）中的带有信号标记的检测抗体混合，从而形成“信号标记的检测抗体－心脑血管疾病生物标志物－捕获抗体－微球”四联复合体；（４）用液相芯片法ｘＭＡＰ检测出四联复合体中不同微球的标记信号，从而确定待检测样品中各种心脑血管疾病生物标志物的存在及含量。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邵棠，黄梅，
申请(专利权)人：邵棠，
类型：发明
国别省市：32
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