本发明专利技术涉及一种氨基化核壳型荧光纳米微球制备技术及其应用。技术方案是，先合成聚丙烯酰胺（ＰＡＧ）与荧光物质嵌合的核心纳米微球。然后再在核心微球外面包覆氨基化聚苯乙烯，制备成氨基化核壳型荧光纳米微球。这种方法制备的荧光纳米微球既有利于封闭和保护荧光物质，防止荧光泄漏，延长荧光衰减时间，又使得纳米微球外表面含有丰富的氨基基团，方便荧光纳米微球与抗原、抗体等蛋白质和多肽的交联。直接用双功能试剂－戊二醛就能使荧光纳米颗有效地标记抗体。氨基化核壳型荧光纳米微球可广泛应用于细胞因子、激素、各种标记蛋白的示踪和定量检测。也可作为微型生物传感器用于蛋白质相互作用、ｐＨ值及离子变化的检测。
【技术实现步骤摘要】
荧光免疫检测纳米材料技术
技术介绍
荧光纳米微球是近年来出现的一种新的纳米材料，广泛应用于探测和示 踪细胞内PH值、离子浓度变化、单分子活动，以及体外定量检测细胞因子、标志蛋 白和各种激素。目前荧光纳米微球多采用荧光嵌合方法合成荧光纳米微球，即在合 成制备纳米微球的同时加入荧光物质，使荧光物质嵌入纳米材料内部形成荧光纳米 微球。这种方法合成的荧光纳米微球容易产生荧光泄漏现象，使得荧光纳米微球中 的荧光含量逐渐减少，本底荧光信号较高。为解决这一问题， 一般采用在荧光纳米 微球外面包覆一个外壳，制备成核壳型荧光纳米微球，来减少荧光物质的泄漏。目 前，核心纳米材料主要有聚丙烯酰胺(PAG)、葡聚糖、硅胶等材料，荧光物质主要 有无机金属螯合物〔联吡啶钌、镧系元素铕(Eu)、锝(Td)〕、有机荧光染料Cy5、 Cy3、异硫氰酸荧光素(FITC)、 Fura-2等。外壳多采用硅胶(Si02)材料，在合成 核心微球后再包覆Si02。 Si02包覆的核壳荧光纳米微球比较适合于PH值或离子生 物传感器的应用，但不便于与抗体、抗原或半抗原等物质交联，不适合于采用均相 荧光分析法(homogeneous fluroimmunoassay, HFIA)均相免疫检测法、双抗体标 记免疫检测法等时间分辨荧光免疫分析(time-resolued fluroimmunoassay, TRFIA) 技术生物分子进行定量检测。参考文献1. Lovgren T， et al. One—step all—in-one dry reagent immunoassays with fluorenscent erupium chelate label and time-resolved fluorometry. Clinical Chemistry, 1996， 42 (8): 1196-12012. Huhtinen P, et al. Quantitative, rapid Europium ( III ) nanoparticle-label-based al1—in-one dry-reag ent immunoassay for thyroid-stimulating hormone. Clinical Chemistry, 2004， 50 (10):1135-363. Leena Kokko,et ai. Europium(III) chelate—dyed nanoparticles as donors in a homogeneous proximity-based immunoassay for estradiol. Analytica Chimica Acta (2004)， 503: 155 - 1624. Koga K， et al. Expression of angiopoietin-2 in human glioma cells and its role for angiogenesis. Cancer Research. 2001; 61:6248—62545. Su隨er JP and Kopelman R. Alexa 488 as an iron sensing molecular and its application in PEBBLE nanosensors. Analyst. 2005; 130:528-5336. Arttamangkul S. et al. Binding and internalization of fluorescent opioid pept ide conjugates in 1iving eel Is. Molecular Pharmocology. 2000; 58: 1570-15807. Kimura H， et al. Rapid and simple quantitation of methamphetamine by using a homogeneous time-resolved fluoroimmunoassay based on fluorescence resonance energy transfer from Europium to Cy5. J. of Analytical Toxicology. 2005; 29:799-8048. Soukka T， et al. Utilization of kinetically enhanced monovalent bindingaffinity by immunoassays based on multivalent nanoparticle-antibody bioconjugates. Anal. Chem. 2001; 73:2254-2260
技术实现思路
本专利技术专利涉及一种氨基化核壳型荧光纳米微球制备技术及其应用。技 术方案是，先合成聚丙烯酰胺(PAG)与荧光物质嵌合的核心纳米微球。然后再在核 心微球外面包覆氨基化聚苯乙烯，制备成氨基化核壳型荧光纳米微球。这种方法制 备的荧光纳米微球既有利于封闭和保护荧光物质，防止荧光泄漏，延长荧光衰减时 间，又使得纳米微球外表面含有丰富的氨基基团，方便荧光纳米微球与抗原、抗体 等蛋白质和多肽的交联。并且，抗体与荧光纳米颗之间通过一个化学臂连接，降低 抗体的空间位阻，可以保护抗体的免疫活性。直接用双功能试剂一一戊二醛就能使 荧光纳米颗有效地标记抗体等多肽物质。聚苯乙烯包覆的核壳型荧光纳米微球可广 泛应用于细胞因子、激素、各种标记蛋白的示踪和定量检测。也可作为微型生物传 感器用于蛋白质相互作用、PH值及离子变化的检测。实现方式本专利技术的目的可以通过以下措施来达到(以制备Eu荧光纳米微球并用于 检测促血管生成素2 (angiopoietin-2， Ang-2 )为例)1. 材料与试剂l.l核心微球单体丙稀酰胺(AG);交联剂二甲基丙稀酰胺(bis);气溶胶琥 珀酸二辛酯磺酸钠(A0T)和乳化剂Brij30;催化剂过硫酸铵(AP)、加速剂四 甲基乙二胺(TEMED);有机溶液正己烷；磷酸缓冲液(PBS), PH7.4;荧光材料 Eu螯合物TEKES-Eu1.2外壳单体:苯乙烯(Styrene, St )、氨基官能团单体(Aminoethy lmethacry late hydrochloride, AEMH)、 乳化剂(Hexadecyltrimethylammonium bromide, HDTAB)、 引发剂 (2,2' -azobisisobutyramidine dihydrochloride , AIBA 或 2,2' 一azobisdimethylenisobutyramidine dihydrochloride, ADIBA)、 终止剂(对苯.二 酴Hydroquinone)。2. 氨基化核壳荧光纳米微球制备配方见下表表l聚丙烯酰胺核心微球(core)合成配方组分PBSAGbis" 。正己垸AOT Brij30 —EuAPTEMED剂量1ml8g0.3g 50 ug19ml 0.2g 0本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种荧光纳米微球制备技术。其特征是纳米微球为核壳结构，核心为聚丙烯酰胺（ＰＡＧ）嵌合荧光物质，核心微球外面包覆氨基化聚苯乙烯，富含氨基基团。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王珊珊，
申请(专利权)人：王珊珊，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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