本发明专利技术公开了一种CYP1A2基因多态性的液相芯片检测方法及检测试剂盒，通过对CYP1A2基因多态性CYP1A2*1F(-163C＞A)、CYP1A2*1D(-2467delT)设计引物和探针，将探针与微球共价结合形成的探针微球混合物，与PCR扩增产物杂交，加入链霉亲和素藻红蛋白后，可检测出不同微球的荧光信号，从而确定待检测样品中CYP1A2基因多态性的类型。本发明专利技术所述的方法及试剂盒具有高灵敏度、高通量性、检测快速、准确等优点，能够对CYP1A2基因多态性进行检测和鉴定分型，同时为药物代谢方面及个性化用药提供重要的参考依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及体外检测技术、医学和生物
，具体涉及CYP1A2基因多态性的液相芯片检测方法及其检测试剂盒。
技术介绍
CYP1A2是一种重要的细胞色素P450酶(cytochrome P450, CYP)，基因定位于人类第15号染色体上，包括7个外显子和6个内含子。CYP1A2参与多种药物在体内的生物转化，以及一些环境毒素的代谢和致癌物质的激活过程。目前已知CYPlA参与咖啡因、华发林、茶碱、普萘洛尔、美西律、维拉帕尔、硝苯地平、他克林等几十种药物的代谢过程。CYP1A2 基因多态性是导致是CYP1A2酶活性及可诱导性产生个体差异的基础，是引起药物疗效和毒性出现个体及种族差异的重要原因。因此，对CYP1A2基因多态性的鉴定分型在个性化用药和安全用药中具有重要的指导意义。CYP1A2的基因多态性主要包括CYP1A2*1F(-163C> Α)的点突变和CYPlA2*lD(-M67delT)的缺失突变等基因突变类型。当前国内外广泛使用的分子生物学检测CYP1A2基因多态性的方法中，荧光定量 PCR存在着检测通量的局限性，所以都还不能真正满足临床诊断检测的需要。传统的固相生物芯片(Biochip)技术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁琐的突出弱点。因此临床上需要有一种检测方法，能够迅速、稳定、准确地对前列腺疾病相关的特异基因进行联合检测，液相芯片(xMAP)技术正是这样一种新型检测技术。液相芯片又称液态芯片，能够对少量样本进行定性、定量检测，具有高通量、操作简便、重复性好、灵敏度高、线性范围宽等突出优点。该系统是由许多微球为主要基质构成的，在微球的制造过程当中，掺入了两种不同的红色分类荧光，根据这两种荧光的比例不同，把球形基质分为100种，可以标记上100种不同的探针分子，能同时对一个样品中多达 100种不同的目标分子进行检测。根据检测物的不同，微球表面可以共价结合各种各样的核酸检测探针，在杂交反应进行时再加上荧光标记。在同一反应体系中可以同时加入不同的检测微球，这样就可以利用少量的样本进行快速、高通量的检测。反应结束后，通过微流体技术将微球排成单列快速流经液相芯片检测仪，每个微球可同时被两束激光检测到，红色激光激发微球上的红色分类荧光，将各个不同的反应区分开来而定性；绿色激光则激发结合在待测样本上的荧光标记进行定量。当标记好的待测样本与特定微球上的探针结合在一起时，两束激光所激发的光均可被检测到。最后，通过计算机的高速数字信号处理器，可以自动统计分析得出特定微球上的平均荧光强度，从而确定检测物的种类和数量。本专利技术基于液相芯片技术的高通量、操作简便、重复性好、灵敏度高、线性范围宽等突出优点，对CYP1A2的基因多态性进行联合并行检测，能够在实验和临床检测上得到更好的应用。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题是提供一种检测CYP1A2基因多态性的液相芯片方法及检测试剂盒。该方法及试剂盒包含对多种CYP1A2基因多态性的联合检测，并可以对药物代谢方面和个性化用药提供重要的参考依据。本检测方法及试剂盒具有高灵敏度、高特异性、高准确度、检测迅速等优点。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下在本专利技术的一方面，提供一种检测CYP1A2基因多态性的液相芯片方法，包括以下步骤(1)包含多种不同荧光编码的微球(Beads)(如羧基(-C00H)微球)，每种微球上分别共价结合针对CYP1A2的基因多态性位点所设计的特异性核酸探针；所述的CYP1A2 的基因多态性位点包含以下突变基因的任意一种或两种或加上其它突变基因的组合 CYP1A2*1F(-163C > A)、CYP1A2*1D(_2467delT)；(2)针对CYP1A2的多种突变基因，分别设计上下游引物，其中一条引物含有生物素(Biotin)标记；对不同的突变基因的DNA，通过PCR扩增出相应的产物；(3)将步骤⑴含有特异性核酸探针的微球与步骤Q)CYP1A2突变基因的PCR扩增产物混合杂交，加入链霉亲和素-藻红蛋白(Mi^ptavidin-PE)后，通过液相芯片xMAP 方法检测荧光信号；(4)根据检测到的荧光信号，从而确定检测样品中是否存在CYP1A2突变基因，并对其基因多态性进行鉴定分型。以上检测方法的步骤(1)中，所述的微球可以是平均直径为5.6μπι，结合了不同荧光染料的聚苯烯微球，即颜色编码微球(Color-coded beads) 0步骤(1)中，所述的共价结合于微球上的针对CYP1A2的基因多态性位点所设计的特异性核酸探针，包括如下序列，其中5’端含氨基修饰野生型CYPlA2*lF-wt :5，-AminolinkerC12 ATGCGTCCTGGGCCCACAGAG-3，，如 SEQ ID NO. 1 所示；突变型CYPlA2*lF-mut :5，-AminolinkerC12 ATGCGTCCTGTGCCCACAGAG-3，，如 SEQ ID NO. 2 所示；野生型CYPlA2*lD-wt :5，-AminolinkerC12 GTTGGGGTTCATGTGCCACAA-3，，如 SEQ ID N0. 3 所示；突变型CYPlA2*lD-mut :5，-AminolinkerC12 GTTGGGGTTCTGTGCCACAA-3，，如 SEQ ID N0. 4 所示；或者包含有上述序列或其互补序列的向5’端或/和3’端延长的序列；或者与上述序列或其互补序列的同源性大于85%的序列；或者与上述序列的碱基互补序列；或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。步骤O)中，所述的针对CYP1A2的多种突变基因所设计的上下游引物，包括如下序列，其中上游引物5’端含生物素Biotin标记CYP1A2*1F 上游引物 5，-biotin CAGCGTTCATGTTGGGAATCTT-3，，如 SEQ ID N0. 5 所示；下游引物 5’ -GCTGAGGGTTGAGATGGAGACAT-3，，如 SEQ ID N0. 6 所示；CYP1A2*1D 上游引物 5，_biotin AGGCTGAGGCAAGAGGATTGT-3，，如 SEQ ID N0. 7 所示；下游引物 5’ -AGGAGGAGGACAAGCCTTAAATTG-3，，如 SEQ ID N0. 8 所示；或者包含有上述序列或其互补序列的向5’端或/和3’端延长的序列；或者与上述序列或其互补序列的同源性大于85%的序列；或者与上述序列的碱基互补序列；或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。在本专利技术的另一方面，提供一种检测CYP1A2基因多态性的试剂盒，包含共价结合了针对CYP1A2基因多态性位点的特异性探针的微球混合物、所述的CYP1A2突变基因的上下游引物、链霉亲和素-藻红蛋白和质控品。以上试剂盒中所述的质控品包含阳性对照和阴性对照，其中阳性对照为含有各种 CYP1A2基因多态性位点的质粒的混合液；阴性对照为不含有CYP1A2基因多态性位点的质粒溶液；所述的微球混合物，根据不同检测样品的需要自由组合。在本专利技术的另一方面，提供一种检测CYP1A2基因多态性的试剂盒在检测体外样品中的应用；以及通过检测体外样品，对药物代谢方面及个性化用药进行指导中本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邵棠，涂文娟，李玲，邓景人，陈庆，
申请(专利权)人：邵棠，
类型：发明
国别省市：
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