针对2种按蚊检测的探针、基因芯片和方法技术

本发明专利技术属于生物检测鉴定领域，涉及针对2种按蚊(中华按蚊、大劣按蚊)检测的探针、基因芯片和方法。一种针对2种按蚊检测的探针，包括：用于检测中华按蚊的探针：3’-CCTCATTCTTTGAYCCAGCTG-5’；和用于检测大劣按蚊的探针：3’-CACCAGATATAGCATTTCCTC-5’。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测鉴定领域，涉及针对2种按蚊(中华按蚊、大劣按蚊)检测的探针、基因芯片和方法。
技术介绍
按蚊，蚊科(Culicidae)按蚊亚科(Anophelinae)按蚊属(Anopheles)昆虫的统称。按蚊广布全世界，已知近450种和亚种，分归于6个亚属，但中国仅有按蚊亚属和塞蚊亚属，共约60种和亚种。按蚊传播疟疾，对人类的健康带来危害。疟疾是经按蚊叮咬或输入带疟原虫者的血液而感染疟原虫所引起的虫媒传染病。寄生于人体的疟原虫共有四种，即间日疟原虫，三日疟原虫，恶性疟原虫和卵形疟原虫。在我国主要是间日疟原虫和恶性疟原虫。中华按蚊(Anophelessinensis)是中国记述最早和研究最广的蚊虫，是中国广大平原地区传播疟疾的重要媒介，也是马来丝虫病的重要媒介之一。有些地区也曾从这种按蚊分离到流行性乙型脑炎病毒。大劣按蚊(Anophelesdirus)，分布于海南岛的山林地区，是当地疟疾传播的重要媒介。此外，广西、云南和西藏也有记载。这种按蚊也是东南亚疟疾传播的重要媒介之一。目前，口岸媒介生物的传统鉴定方法为形态学鉴定方法，主要是依据有形态学鉴定经验、具有媒介生物形态鉴定知识的实验室专业人员根据医学媒介分类检索表进行种类鉴定。受限于鉴定人员的经验积累、专业要求、标本完整性与发育阶段，传统媒介蚊种鉴定方法存在着鉴定专家数量有限、鉴定周期长、鉴定效率低等问题。比如，首先，传统的分类方法在鉴定蚊虫复合体、近缘种存在一定困难；其次，在国境口岸蚊媒监测和交通工具等的卫生检疫工作中，受不同的采集工具、采集方法的影响以及标本运送过程的限制，当专业技术人员鉴定时，许多蚊虫标本已经是残缺不全，往往是腹部鳞片或翅等重要体征脱落或受损，难以进行准确的形态分类；再次，对于截获的卵、幼虫和蛹，整个鉴定过程大致需要数周的时间，由于鉴定特征细微难辨，往往需要培养至成虫再鉴定，如果是少见的国外种类，还要请国外专家协助鉴定，鉴定所需的时间就更多了。近年来，分子生物学技术的迅速发展，显示了在蚊类鉴别应用中的极大潜力，形成了许多分子鉴别方法，成为解决当前蚊虫分类难题的新钥匙。基因芯片技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。基因芯片主要用于基因检测工作。基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了针对2种按蚊检测的探针、基因芯片和方法。首先，本专利技术的内容包括针对2种按蚊检测的探针，包括：用于检测中华按蚊的探针：3’-CCTCATTCTTTGAYCCAGCTG-5’，如序列表SeqIDNo.1所示；和用于检测大劣按蚊的探针：3’-CACCAGATATAGCATTTCCTC-5’如序列表SeqIDNo.2所示。进一步地，本专利技术的内容还包括一种针对2种按蚊检测的基因芯片，包括上述探针。进一步地，所述的基因芯片，还包括质控探针：3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’，如序列表SeqIDNo.3所示。进一步地，所述探针和质控探针的3′端加入6个碱基T且3′末端氨基修饰作为连接臂，使其固定在芯片上。进一步地，所述质控探针5′端标记生物素。本专利技术的基因芯片的检测方法，包括以下步骤：1)提取待测样本的模板DNA；2)模板DNA的扩增与标记：将1)提取的模板DNA利用通用引物进行PCR扩增，所述通用引物为：Lian6-1:TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA，Lian6-2:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG(SeqIDNo.4、SeqIDNo.5)；3)芯片杂交：将基因芯片与模板DNA进行杂交；4)杂交后清洗：杂交完成后立即清洗基因芯片；5)标记：向杂交后的基因芯片加入标记液，充分反应后清洗并干燥；6)结果分析：向基因芯片加入检测液，充分反应后分析结果。本专利技术的有益效果为：本专利技术通过对中华按蚊和大劣按蚊的基因序列进行比对，针对其基因序列保守位置设计特异性寡核苷酸探针，利用基因芯片的检测方法，实现中华按蚊和大劣按蚊的快速检测，提高检测的准确率和特异性，具有简便快速、廉价、安全、灵敏度高、特异性强的特点，可以为国境口岸蚊媒监测提供有力的技术支持。为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本专利技术。附图说明图1为本专利技术的探针于芯片上点样分布模式图，其中D1为阳性质控点，B2、C2为中华按蚊探针，B3、C3为大劣按蚊探针。其余位置为空白点或空白对照。图2为中华按蚊标本杂交检测结果图。图3为大劣按蚊标本杂交检测结果图。图4为中华按蚊标本案梯度浓度稀释后检测的结果图。图5为大劣按蚊标本案梯度浓度稀释后检测的结果图。具体实施方式【实施例1】基因芯片制备方法11、探针的设计：首先从NCBI基因数据库中下载相应的基因序列，具体选择NCBI号为JQ728141的中华按蚊，NCBI号为JQ728303的大劣按蚊使用软件对序列进行比对。根据比对结果在基因序列保守位置，即细胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)基因，设计特异性寡核苷酸探针、质控探针和特异性引物。其中，本实施例中特异性探针和质控探针如表1、表2所示。表1探针表2质控探针2、探针的合成：每条探针的3′端加入6个碱基T且3′末端氨基修饰作为连接臂，使其固定在芯片上；质控探针除了3′末端进行氨基修饰外，5′端同时标记生物素。3、芯片的制备：将合成的探针用去离子水稀释成100uM，分别取10ul探针溶液和10ul体积芯片点样液混匀，使探针终浓度为50uM。探针于聚苯乙烯芯片上点样的分布如图1所示，其中D1为阳性质控点，B2、C2为中华按蚊探针，B3、C3为大劣按蚊探针。其余位置为空白点或空白对照。点样过程保持一定湿度，点样完成后将芯片置于干燥器中避光常温静置24小时。点制好的芯片常温干燥保存。【实施例2】检测鉴定方法1、提取待测样本的模板DNA：使用商品化动物组织基因组DNA提取试剂盒提取蚊虫DNA。2、模板DNA的扩增与标记：模板DNA的扩增采用通用PCR引物，所述通用PCR引物的序列如表3所示；模板DNA的扩增，其扩增的聚合酶链式反应的反应体系如表4。PCR扩增反应程序如表5。表3引物序列表4反应体系<本文档来自技高网...

【技术保护点】
针对2种按蚊检测的探针，包括：用于检测中华按蚊的探针：3’‑CCTCATTCTTTGAYCCAGCTG‑5’，如序列表Seq ID No.1所示；和用于检测大劣按蚊的探针：3’‑CACCAGATATAGCATTTCCTC‑5’如序列表Seq ID No.2所示。

【技术特征摘要】
1.针对2种按蚊检测的探针，包括：
用于检测中华按蚊的探针：3’-CCTCATTCTTTGAYCCAGCTG-5’，如序列表SeqIDNo.1
所示；
和用于检测大劣按蚊的探针：3’-CACCAGATATAGCATTTCCTC-5’如序列表SeqIDNo.2
所示。
2.一种针对2种按蚊检测的基因芯片，包括权利要求1所述的探针。
3.根据权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：廉国胜，田绿波，杨泽，林继灿，汪海波，柯明剑，莫秋华，伍碧梅，闫文莲，苏影，
申请(专利权)人：珠海国际旅行卫生保健中心，
类型：发明
国别省市：广东;44