一种用于检测膀胱癌的探针组及基因芯片制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测膀胱癌的探针组，由探针1-探针25共25条探针组成，所述探针1-探针25的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-25，将上述的寡核苷酸探针1-25通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列即为基因芯片。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术所提供的将探针组和基因芯片应用于膀胱癌的早期检测具体有以下优点：1、特异性好：用于检测膀胱癌的新的基因组合可同时检测膀胱癌病原体的25个指标，特异性高达95%；2、灵敏度和准确率高：敏感性达95%，临床符合率达95%；3、对膀胱癌进行快速侦检和预后监控；4、用于各种类型的膀胱癌的诊断和预后监控，尤其可用于早期膀胱癌的诊断。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物基因领域，具体涉及一种用于检测膀胱癌的探针组及基因芯片。
技术介绍
膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤。是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位，而在西方其发病率仅次于前列腺癌，居第2位。2012年全国肿瘤登记地区膀胱癌的发病率为6.61/10万，列恶性肿瘤发病率的第9位。膀胱癌可发生于任何年龄，甚至于儿童。其发病率随年龄增长而增加，高发年龄50～70岁。男性膀胱癌发病率为女性的3～4倍。膀胱癌癌主要是根据患者既往史、家族史，结合症状和查体做出初步判断，并进一步进行相关检查。检查方法包括尿常规检查、尿脱落细胞学、尿肿瘤标记物、腹部和盆腔B超等检查。根据上述检查结果决定是否行膀胱镜、静脉尿路造影、盆腔CT或/和盆腔MRI等检查明确诊断。其中，膀胱镜检查是诊断膀胱癌的最主要方法。目前，膀胱癌尚没有有效早期诊断与预后指标。基因芯片(Gene Chip)是将大量的寡核苷酸分子固定于固相载体上形成DNA微点阵，借助核苷酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效解读和分析。基因芯片起源于20世纪80年代，近年来得到了迅猛的发展，但主要是应用于医药和研究领域，目前并没有将基因芯片技术应用于膀胱癌早期检测的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了特异性好、灵敏度高、准确率高的用于检测膀胱癌的探针组及基因芯片。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：一种用于检测膀胱癌的探针组，由探针1-探针25共25条探针组成，所述探针1-探针25的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-25。用于检测膀胱癌疾病的探针组，包括25个基因片段，其中第25种基因片段为质控基因，25个基因片段是针对膀胱癌的25个指标而设计的，利用25个基因片段共同来检测膀胱癌基因表达谱的改变，进而对膀胱癌进行侦检和预后监控。25种基因片段如表1和表2所示，其中表1为序列1-13，表2为序列14-25：表1表225个基因片段的详细序列如序列表1-2中序列1-25所示。上述用于检测膀胱癌的探针组可应用于生物芯片技术(包括基因芯片技术、蛋白芯片技术、组织芯片技术、细胞芯片技术等)、聚合酶链反应(PCR)、核酸分子杂交技术以及其他病原体基因诊断技术。本专利技术的第二个目的是提供了一种用于检测膀胱癌的基因芯片，所述基因芯片是将上述的寡核苷酸探针1-25通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列。进一步的，上述的一种用于检测膀胱癌的基因芯片，所述探针1-探针24为检测寡核苷酸探针，探针25为质量控制寡核苷酸探针。进一步的，上述的一种用于检测膀胱癌的基因芯片，所述基因芯片中的探针标记技术为核素标记、生物素标记、地高辛标记、荧光素标记、胶体铁标记、胶体金标记或联合标记。本专利技术的第三个目的是提供了上述的用于检测膀胱癌的基因芯片在检测早期膀胱癌中的应用。进一步的，上述的应用，所述检测早期膀胱癌过程中，检测样本为膀胱癌新鲜组织或膀胱癌患者的尿脱落细胞。本专利技术的有益效果为：本专利技术所提供的将探针组和基因芯片应用于膀胱癌的早期检测在我国尚属首次，这将会极大促进膀胱癌早期诊断的发展，具体有以下优点：1、特异性好：现有的膀胱癌的诊断仅是检测一个或几个指标缺乏特异性，所以容易引起误诊，尤其是早期膀胱癌的误诊率更是高达70％以上。本专利技术用于检测膀胱癌的新的基因组合可同时检测膀胱癌病原体的25个指标，特异性高达95％；2、灵敏度和准确率高：敏感性达95％，临床符合率(准确率)达95％；3、可对膀胱癌进行快速侦检和预后监控；4、可用于各种类型的膀胱癌的诊断和预后监控，尤其可用于早期膀胱癌的诊断。为保证基因芯片的质量，应注意以下事项：1)样品核酸的提取：提取的核酸必须具有较高的纯度(OD260/0D280比值应大于1.50)和一定的量(应10ng-100ng)，以保证标记的质量和特异性扩增，如果纯度不够，可能导致后面的杂交出现非特异点；2)样品核酸的标记：掺入的标记物必须达到一定的浓度(每个反应掺入的标记物为0.1-1μg)，以保证杂交点的灵敏度，若浓度不够，杂交结果常会出现假阴性；3)同源核酸杂交：应掌握杂交温度控制在42℃左右，温度过低，会出现非特异杂交点，使特异性降低，温度过高，则往往出现假阴性。膀胱癌早期诊断基因芯片和常规检测疾病的方法向比较具有以下优点：1、准确，基因芯片设有阳性和阴性对照，可避免环境和人为因素造成的错误的诊断；2、快速，常规检测需要一周的时间，而芯片只需8个小时左右；3、灵敏，芯片的灵敏性(0.1pg)可比PCR技术高1000倍；4、信息量大：PCR一次只检一种指标，而芯片一次可检测20～30种指标。附图说明图1为芯片样式设计图。图2为芯片检测结果。具体实施方式实施例1：一、用于检测膀胱癌的探针组的基因芯片的制备：1、材料和方法1.1材料：1.1.1试剂：主要试剂RNA提取试剂(Trizol Reagent)、饱和酚、DEPC、DNA marker、Oligod(T)18、DIG DNA标记试剂盒、地高辛杂交检测试剂盒，均购自上海生工。逆转录酶M-MLV(RNase H-)、Taq酶、Agarose Gel、RNA酶抑制剂、琼脂糖(Agarose)、DNA纯化试剂盒，均购自大连宝生物公司。引物由上海生工生物工程公司合成；其他试剂均为国产分析纯。1.1.2临床资料：(1)膀胱癌新鲜组织样本：组织标本取自甘肃省人民医院在2011年10月-2013年4月期间手术切除的新鲜膀胱癌标本,前均未做化疗或放疗,术后经病理证实,同时距肿瘤边缘5－10cm以上切取正常组织(术后病理证实无癌细胞侵润)作为对照。标本离体后5min内即投入液氮罐内冻存。(2)膀胱癌患者尿脱落细胞样本：检测样本为甘肃省人民医院在2012年4月-2013年4月期间膀胱癌及正常人尿脱落细胞样本的100例细胞检测样本(其中膀胱癌样本50例)分别用芯片方法进行对比检测，保存于-80℃。1.1.3仪器和设备：仪器和设备：PCR仪购自杭州郎基；点样器；杂交仪；扫描仪均为自行设计，委托生产厂家制造。1.2引物设计：确定膀胱癌肿瘤标志物数条序列，然后使用DNAStar分析设计出这些引物。具体引物如上述表1-表2所示。1.3基因芯片的制作：1.3.1膀胱癌核酸的提取(膀胱癌新鲜组织样本)：...

【技术保护点】
一种用于检测膀胱癌的探针组，其特征在于，由探针1‑探针25共25条探针组成，所述探针1‑探针25的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1‑25。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测膀胱癌的探针组，其特征在于，由探针1-探针25共25条探针组成，所述探针1-探针25的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-25。
2.一种用于检测膀胱癌的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片是将权利要求1中所述的寡核苷酸探针1-25通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测膀胱癌的基因芯片，其特征在于，所述探针1-探针24为检测寡核苷酸探针，探针25为...

【专利技术属性】
技术研发人员：车团结，陈一戎，郭柏鸿，李琳，陈小兰，蔡传勇，
申请(专利权)人：兰州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：甘肃;62