【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病毒检测，具体涉及一种hpv病毒的多重q-pcr检测试剂盒及其制备。
技术介绍
1、本节中的陈述仅提供与本申请公开相关的背景信息，并且可能不构成现有技术。
2、人乳头瘤病毒(human papillomavirus,hpv)属于乳头瘤病毒科，是一种小分子的、无被膜包被的环状双链dna病毒。hpv有多种亚型，根据其致癌能力，持续反复的hr-hpv感染可能使病毒dna整合至宿主基因组中，破坏自身基因组和宿主染色体结构，进而导致癌基因被激活，引起癌症的发生。宫颈癌是威胁女性生命健康最主要的恶性肿瘤之一，其主要致癌因素是持续性人乳头瘤病毒(hpv)感染。我国女性高危型hpv感染率为19％，与全球其他地区基本一致，感染率位于前5的hpv型别分别为16、52、58、53、18型。
3、由于hpv病毒是不能够被体外培养的，目前针对hpv的检测都是针对其病毒核酸进行的检测，荧光定量pcr正不断应用于临床标本的检测，在检测hpv病毒中将会有很大的发展潜力。然而现有的试剂盒中的生物酶等对温度的变化极其敏感，在运输过程中需要采用严格的冷链运输，否则将影响试剂盒的检测结果准确性甚至可能使得试剂盒完全失效而造成损失。
4、现有技术提供了用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒及其制备和应用，该试剂盒中将pcr体系混合后再进行包装和运输，其中pcr混合体系中包括多种hpv的特异性探针和引物序列，其中包括hpv16和56、18和45、35和59、39和51、58和52、33、31、68等单一或混合类型。该现有技术提
5、然而多重pcr虽然能够在一个混合体系中同时检测多种特异性分子的存在，起到同时快速鉴定多种hpv病毒型的作用；但由于混合体系中包含多对针不同hpv的引物分子，因此对引物的要求更高，不仅需要针对不同病毒型均有特异性，同时需要不同引物对之间不存在彼此的干扰，这极大提升了引物设计的难度。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于：针对目前hpv筛查运输保存条件限制、效率较低且无法满足应用需求的问题，提供了一种hpv病毒的多重q-pcr检测试剂盒及其制备，能够一步同时检测hpv16、18、11、6病毒，引物对之间互不干扰，检测灵敏度高，提升检测效率，满足多种需求。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种hpv病毒的多重q-pcr检测引物对，包括如seq id no:2、seq id no:3、seq idno:6、seq id no:7、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:14和seq id no:15所示的引物。
4、一种hpv病毒的多重q-pcr检测试剂盒，包括hpv16、hpv18、hpv11和hpv6的q-pcr引物。
5、根据一种优选的实施方式，所述hpv16的q-pcr引物包括如seq id no:2所示的引物1和如seq id no:3所示的引物2；
6、所述hpv18的q-pcr引物包括如seq id no:6所示的引物3和如seq id no:7所示的引物4；
7、所述hpv11的q-pcr引物包括如seq id no:10所示的引物5和如seq id no:11所示的引物6；
8、所述hpv6的q-pcr引物包括如seq id no:14所示的引物7和如seq id no:15所示的引物8。
9、根据一种优选的实施方式，所述检测试剂盒还包括pcr缓冲液、冻干保护剂、taqdna聚合酶、udg酶、人乳头瘤病毒分型的探针、dntp、复溶液、阳性对照样品和阴性对照样品；
10、所述冻干保护剂包括甜菜碱、海藻糖、pvp30、peg35k、蔗糖及bsa。
11、优选地，所述冻干保护剂中各组分的含量为：甜菜碱0.05 2μm，海藻糖0.1％5wt％，pvp300.1％5wt％，peg35k 0.05％7wt％，蔗糖0.1％6wt％，bsa 0.1％3wt％。
12、冻干保护剂中的甜菜碱可抑制反应中的非特异性扩增，海藻糖和蔗糖可在冻干失水过程中保护蛋白的同时，作为骨架为小球赋形，bsa主要为保护蛋白作用，pvp30和peg35k主要作为骨架支持冻干赋形，同时促进q-pcr反应。
13、优选地，所述复溶液包括：0-3mmol/l mgcl2溶液、0-100mmol tris-hcl(ph＝8.3)、0-150mmol/l kcl溶液、0-80mmol/l(nh4)2so4溶液、非离子型表面活性剂。
14、优选地，所述人乳头瘤病毒分型的探针包括序列如seq id no:4所示的hpv16的探针1、序列如seq id no:8所示的hpv18的探针2、序列如seq id no:12所示的hpv11的探针3和序列如seq id no:16所示的hpv6的探针4。
15、优选地，所述探针1、探针2、探针3和探针4分别标记不同荧光；
16、优选地，所述探针1标记fam荧光，所述探针2标记hex荧光，所述探针3标记rox荧光，所述探针4标记cy5.5荧光。通过四重实时荧光同时检测出样本中的hpv16、18、11、6病毒。本专利技术产品适用于基层的筛查，帮助医生快速判断病人是否感染hpv16、18、11、6分型病毒，以便后续的精准治疗。
17、优选地，所述hpv16的特异性基因序列高度保守区域核酸序列如seq idno:1所示；所述hpv18的特异性基因序列高度保守区域核酸序列如seq id no:5所示；所述hpv11的特异性基因序列高度保守区域核酸序列如seq id no:9所示；所述hpv6的特异性基因序列高度保守区域核酸序列如seq id no:13所示。
18、一种hpv病毒的多重q-pcr检测试剂盒的制备方法为：将各组分充分混匀，均匀分装至pcr管进行制珠，放入冻干机中进行冻干。
19、根据一种优选的实施方式，所述的冻干曲线为0℃、1h、真空度0pa；45℃、45min、真空度0pa；45℃、90min、真空度0pa；40℃、660min、真空度10pa；32℃、8min、真空度10pa；-32℃、420min、真空度10pa；28℃、2h、真空度10pa；28℃、300min、真空度10pa。
20、在真空冷冻制备成冻干颗粒，从而摆脱了运输过程中对冷链的依赖，可以在常温条件下进行运输和储存，保障了酶的活性，提升了检测结果的准确性；而将pcr体系直接配制成混合溶液在包装和使用时都无需分开包装临时添加，为社区快速检本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种HPV病毒的多重Q-PCR检测引物对，其特征在于，包括如SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:15所示的引物。
2.一种HPV病毒的多重Q-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括HPV16、HPV18、HPV11和HPV6的Q-PCR引物。
3.根据权利要求2所述的一种HPV病毒的多重Q-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述HPV16的Q-PCR引物包括如SEQ ID NO:2所示的引物1和如SEQ ID NO:3所示的引物2；
4.根据权利要求2所述的一种HPV病毒的多重Q-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括PCR缓冲液、冻干保护剂、Taq DNA聚合酶、UDG酶、人乳头瘤病毒分型的探针、dNTP、复溶液、阳性对照样品和阴性对照样品；
5.根据权利要求4所述的一种HPV病毒的多重Q-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述冻干保护剂中各组分的含量为：甜菜碱0.05-2μ
6.根据权利要求4所述的一种HPV病毒的多重Q-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述人乳头瘤病毒分型的探针包括序列如SEQ ID NO:4所示的HPV16的探针1、序列如SEQ ID NO:8所示的HPV18的探针2、序列如SEQ ID NO:12所示的HPV11的探针3和序列如SEQ ID NO:16所示的HPV6的探针4。
7.根据权利要求6所述的一种HPV病毒的多重Q-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述探针1标记FAM荧光，所述探针2标记HEX荧光，所述探针3标记ROX荧光，所述探针4标记CY5.5荧光。
8.根据权利要求7所述的一种HPV病毒的多重Q-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述HPV16的特异性基因序列高度保守区域核酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述HPV18的特异性基因序列高度保守区域核酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述HPV11的特异性基因序列高度保守区域核酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述HPV6的特异性基因序列高度保守区域核酸序列如SEQ ID NO:13所示。
9.如权利要求2-8任一项所述的一种HPV病毒的多重Q-PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将各组分充分混匀，均匀分装至PCR管进行制珠，放入冻干机中进行冻干。
10.根据权利要求9所述的一种HPV病毒的多重Q-PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于，冻干曲线为0℃、1h、真空度0Pa；45℃、45min、真空度0Pa；45℃、90min、真空度0Pa；40℃、660min、真空度10Pa；32℃、8min、真空度10Pa；-32℃、420min、真空度10Pa；28℃、2h、真空度10Pa；28℃、300min、真空度10Pa。
...【技术特征摘要】
1.一种hpv病毒的多重q-pcr检测引物对，其特征在于，包括如seq id no:2、seq idno:3、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:14和seq idno:15所示的引物。
2.一种hpv病毒的多重q-pcr检测试剂盒，其特征在于，包括hpv16、hpv18、hpv11和hpv6的q-pcr引物。
3.根据权利要求2所述的一种hpv病毒的多重q-pcr检测试剂盒，其特征在于，所述hpv16的q-pcr引物包括如seq id no:2所示的引物1和如seq id no:3所示的引物2；
4.根据权利要求2所述的一种hpv病毒的多重q-pcr检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括pcr缓冲液、冻干保护剂、taq dna聚合酶、udg酶、人乳头瘤病毒分型的探针、dntp、复溶液、阳性对照样品和阴性对照样品；
5.根据权利要求4所述的一种hpv病毒的多重q-pcr检测试剂盒，其特征在于，所述冻干保护剂中各组分的含量为：甜菜碱0.05-2μm，海藻糖0.1wt％-5wt％，pvp300.1wt％-5wt％，peg35k0.05wt％-7wt％，蔗糖0.1wt％-6wt％，bsa0.1wt％-3wt％。
6.根据权利要求4所述的一种hpv病毒的多重q-pcr检测试剂盒，其特征在于，所述人乳头瘤病毒分型的探针包括序列如seq id no:4所示的hpv16的探针1、序列如seq...
【专利技术属性】
技术研发人员：车团结，蔺西军，辛倩，王艳霞，车妍，杨立，何荣霞，刘霞，
申请(专利权)人：兰州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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