本发明专利技术公开了一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物、试剂盒及检测方法，能够快速、简便、准确的检测膀胱癌尿液中miRNA-155的表达量。该专用试剂盒包括检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用逆转录引物和检测引物以及RNA分离液；RNA分离液由2.5%吐温20、50mmol/L三羟甲基氨基甲烷、1mmol/L乙二胺四乙酸和1%牛血清白蛋白组成。本发明专利技术为膀胱癌的早期发现、早期治疗提供了重要的参考依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物、试剂盒，以及检测膀胱癌尿液miRNA-155表达量的方法，属于分子生物学检测
技术介绍
膀胱癌是泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤，在我国的发病率和死亡率均占男性泌尿生殖系统肿瘤的首位，且呈逐年上升趋势。膀胱癌患者初诊时30%已发生肌层浸润，而在非肌层浸润性膀胱癌患者中，仍有30%会复发为浸润性膀胱癌。早期诊断和早期治疗是预防和控制膀胱癌的关键。目前临床上诊断膀胱癌主要依赖于膀胱镜、尿脱落细胞学和影像学检查等。膀胱镜是膀胱癌诊断的常用方法，可造成不同程度的尿道和膀胱损伤以及感染等并发症；尿脱落细胞学检查具有非侵入性、特异性高等优点，其敏感性低于50%，对早期患者仅为30%，易受检测者主观因素的影响；CT和超声检查是目前诊断膀胱癌及术前分期最常用的影像学检查方法，但对膀胱内较小病变不易发现，对膀胱癌分期预测受到一定限制。寻找敏感性、特异性高的早期诊断生物标志物，建立一种经济准确、安全有效的血清学膀胱癌诊断方法是目前关注的焦点。miRNAs是在真核生物中 发现的一类具有调控功能的内源性非编码小分子RNA，其通过对mRNA的完全和部分配对结合，降解mRNA或干扰mRNA的翻译，在转录后水平调控特定基因的表达，从而对细胞增殖、分化与凋亡起到精细调节的作用。近年来研究发现，尿液中存在丰富稳定的miRNAs，其与泌尿系统恶性肿瘤的发生、发展密切相关，为肿瘤的无创性诊断开辟了一条新的途径。并且，随着分子生物学技术的发展，通过实时荧光定量PCR方法检测尿液中微量的miRNAs已成为可能。所谓实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号的积累实时监测PCR的进程，最后通过标准曲线对待测模板进行定量分析。由于该技术操作简便、敏感性高、重复性好，目前已在核苷酸检测领域得到广泛应用。 miRNA-155为癌基因BIC的表达产物，其在造血细胞分化、免疫、肿瘤及心血管等疾病各种生理或病理过程中起着重要的调控作用。2005年1rio应用微阵列芯片技术首次筛选出乳腺癌异常表达的miRNAs谱，发现miRNA-155是上调最明显的miRNAs之一。Zhu等发现miRNA-155的表达水平较正常乳腺组织显著上调，并且其与乳腺癌的TNM分期、淋巴结转移、雌激素受体、孕激素受体呈明显相关。近年来，随着研究的不断深入，发现miRNA-155在肺癌、胰腺癌、肾癌以及头颈部肿瘤中表达均明显升高，并且与肿瘤细胞的增殖、浸润及转移具有密切关系，表明miRNA有可能成为一种良好的肿瘤标志物分子。
技术实现思路
本专利技术的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用试剂盒及检测方法，能够快速、简便、准确的检测膀胱癌尿液中miRNA-155的表达量。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案:一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物，包括:(I) miRNA-155的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID N0:1所示，检测引物的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示:miRNA-155-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCCT-3’ ；miRNA-155-F:5’ -CGCCTTAATGCTAATCGTGAT-3’ ；miRNA-155-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ；(2)miRNA-191的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO:4所示，检测引物的序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示:miRNA-191-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGCTG-3’ ；miRNA-191-F:5’ -GCCAACGGAATCCCAAAAG-3’ ；miRNA-191-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ；(3)miRNA-16的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID N0:7所示，检测引物的序列如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示:miRNA-16-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’ ；miRNA-16-F:5’ -CGCCTAGCAGCACGTAAATA-3’ ；miRNA-16-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用试剂盒，包括上述引物，以及RNA分离液；所述RNA分离液由吐温20、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和水组成，其中，浓度如下:吐温20:2.5% (体积百分数)，三羟甲基氨基甲烷:50mmol/L，乙二胺四乙酸:lmmol/L,牛血清白蛋白:1% (质量百分数)。所述检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液由IXSyber Green I荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁和水组成。优选的，各物质的浓度如下:DNA聚合酶:100U/mL ；dNTPs:0.2mM ;氯化镁:6mM ;三羟甲基氨基甲烷盐酸盐:16.5mM ;氯化钾:89.3mM。上述检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物在定量检测膀胱癌miRNA-155表达量的应用。上述检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用试剂盒在定量检测膀胱癌miRNA-155表达量的应用。 一种检测膀胱癌尿液miRNA-155表达量的方法，步骤如下:(I)分离尿液标本上清液，与等体积的RNA分离液混合，1600g离心5分钟，之后16000g离心10分钟，分离上清；(2) RT-PCR扩增:将上述分离的上清液进行反转录成cDNA，取cDNA为模板，加入引物和PCR反应液，进行PCR反应，检测样本阈值Cq (Test sample);同时以人膀胱癌细胞株T24细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心)中提取miRNAs，逆转录成cDNA作为校对样本，在每个PCR反应板中进行检测，记录Cq值；内参基因miRNA_191、miRNA-16的RT-PCR扩增，除引物采用相对应的逆转录引物和检测引物外，方法相同；(3)制作标准曲线:上述检测完成后，拷贝数以10为底取对数作为横坐标，Cq值为纵坐标作图，绘制标准曲线，计算斜率S，然后根据公式E=IO (_vs)-l，计算扩增效率E ;(4)计算:选中样本和校对样本检测孔，应用实时荧光定量PCR仪的随机软件得出样本阈值Cq (T)和校对样本阈值Cq (C)，根据公式Q= (E+1)_Ag% A Cq=[Cq (T)-Cq (C)],得出基因的校正起始拷贝数Q ;将miRNA-155的Q值与内参基因miRNA_191、miRNA_16的Q值的几何平均数相比，得到miRNA-155的相对表达量。本专利技术的有益效果是，本专利技术建立的膀胱癌尿液miRNA-155检测方法，为膀胱癌的早期发现、早期治疗提供了重要的参考依据。本专利技术利用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测膀胱癌尿液miRNA?155的专用引物，其特征在于，包括：（1）miRNA?155的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ?ID?NO：1所示，检测引物的序列如SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3所示：miRNA?155?RT：5’?GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCCT?3’；miRNA?155?F：5’?CGCCTTAATGCTAATCGTGAT?3’；miRNA?155?R：5’?GTGCAGGGTCCGAGGT?3’；（2）miRNA?191的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ?ID?NO：4所示，检测引物的序列如SEQ?ID?NO：5、SEQ?ID?NO：6所示：miRNA?191?RT：5’?GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGCTG?3’；miRNA?191?F：5’?GCCAACGGAATCCCAAAAG?3’；miRNA?191?R：5’?GTGCAGGGTCCGAGGT?3’；（3）miRNA?16的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ?ID?NO：7所示，检测引物的序列如SEQ?ID?NO：8、SEQ?ID?NO：9所示：miRNA?16?RT：5’?GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA?3’；miRNA?16?F：5’?CGCCTAGCAGCACGTAAATA?3’；miRNA?16?R：5’?GTGCAGGGTCCGAGGT?3’。...
【技术特征摘要】
1.一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物，其特征在于，包括: (1)miRNA-155的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQID N0:1所示，检测引物的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示:miRNA-155-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCCT-3’ ；miRNA-155-F:5’ -CGCCTTAATGCTAATCGTGAT-3’ ；miRNA-155-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ； (2)miRNA-191的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQID N0:4所示，检测引物的序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示:miRNA-191-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGCTG-3’ ；miRNA-191-F:5’ -GCCAACGGAATCCCAAAAG-3’ ；miRNA-191-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ； (3)miRNA-16的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQID NO:7所示，检测引物的序列如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示:miRNA-16-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’ ；miRNA-16-F:5’ -CGCCTAGCAGCACGTAAATA-3’ ；miRNA-16-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。2.一种 检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的专用引物，以及RNA分离液；所述RNA分离液由吐温20、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和水组成，其中，浓度如下:吐温20:2.5%，三羟甲基氨基甲烷:50mmol/L，乙二胺四乙酸:lmmol/L,牛血清白蛋白:1%。3.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：王传新，张欣，刘益民，
申请(专利权)人：山东大学齐鲁医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。