苦豆碱制备肺癌放疗增敏剂的应用制造技术

本发明专利技术公开了苦豆碱作为制备放疗抵抗肺癌细胞自噬水平抑制剂和放疗增敏剂的应用。所述苦豆碱为植物来源的天然化合物，其放疗增敏机制主要是改变细胞自噬水平相关的生物标志物Beclin1、LC3和p62，优选为荧光可视化的LC3(Ad‑mRFP‑GFP‑LC3)。通过检测这些特定的生物标志物，用于评价苦豆碱的抑制放疗抵抗肺癌细胞自噬水平和放疗增敏效应。

Preparation of radiotherapy sensitizing agent for lung cancer using bitter alkali

The invention discloses a bitter alkali bean as the preparation of the radiation resisting lung cancer cell autophagy level inhibitor and the application of the radiation sensitizer. The natural compound aloperin for plant sources, the sensitization mechanism of radiotherapy is mainly related to changes of autophagy level of biological markers Beclin1, LC3 and p62, preferably fluorescent visualization of the LC3 (Ad mRFP GFP LC3). These specific biomarkers were used to evaluate the inhibitory effect of radiotherapy on lung cancer cell autophagy and radiosensitization by radiotherapy.

【技术实现步骤摘要】
苦豆碱制备肺癌放疗增敏剂的应用
本专利技术涉及抑制细胞增殖、增强肺癌放疗敏感性、调控细胞自噬水平的苦豆碱，通过检测某些特定的生物标志物，用于评价苦豆碱的抑制放疗抵抗肺癌细胞自噬水平和放疗增敏效应。
技术介绍
肺癌(lungcancer)，全世界肿瘤病人死亡的主要原因，每年大约有160万肺癌患者死亡。临床上，放疗已成为肺癌患者的主要治疗方法之一，然而，最近研究发现，肿瘤细胞逐渐对放疗引起的细胞毒效应产生了抵抗作用，导致肺癌放疗疗效和生存预后显著变差。因而，阐明肺癌细胞放疗放疗抵抗的调控机理，有助于发现肺癌治疗和预后的新靶点。细胞自噬(autophagy)是细胞内的一个动态平衡过程，其受到精细的分子调控，通过降解细胞内的受损细胞器、错误折叠蛋白质等物质，供细胞正常生命活动需要。目前，研究发现了36个细胞自噬相关分子(autophagy-relatedgenes,Atgs)，包括Atg6/Beclin1、Atg8/LC3、p62等。在应激反应的刺激下，自噬水平的改变，可以为细胞产生应对不良刺激的保护性反应。越来越多的研究表明，细胞自噬在肿瘤的发生发展中发挥重要的功能，特别是在放疗或化疗药物的作用下，自噬表现出促肿瘤、抗肿瘤的“双刃剑”作用，从而影响肿瘤细胞的治疗疗效。细胞自噬的异常涉及到肿瘤细胞对放化疗的敏感性，对细胞自噬调节机制研究的成果正在转化为肿瘤治疗的新靶点。苦豆碱(Aloperine)是苦参属植物来源的天然生物碱，在体内外实验中表现出良好的抗炎、抗肿瘤活性。研究发现，苦豆碱能够抑制黑色素瘤细胞的增殖、促进细胞凋亡，同时动物实验表明苦豆碱具有相对安全性、无明显副作用等特点。在结肠癌细胞中，苦豆碱能够明显地抑制细胞增殖、导致细胞周期阻滞，进而产生抗肿瘤活性。然而，尚未有苦豆碱在肺癌放疗抵抗效应中的研究发现。因而，阐明苦豆碱增强肺癌放疗敏感性的分子机制，将有助于苦豆碱成为制备肺癌细胞放疗增敏药物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供苦豆碱作为放疗抵抗肺癌细胞自噬水平抑制剂和放疗增敏药物的应用。所述苦豆碱为植物来源的天然化合物，其放疗增敏机制主要是改变细胞自噬水平，及其相关的生物标志分子Beclin1、LC3和p62的变化，优选为LC3(Ad-mRFP-GFP-LC3)。通过检测这些特定的生物标志物，用于评价苦豆碱的抑制放疗抵抗肺癌细胞自噬水平和放疗增敏效应。下面对本专利技术作进一步说明：本专利技术确定了苦豆碱抑制细胞自噬水平和增强肺癌放疗敏感性的新的分子机制，明确苦豆碱的应用改变了细胞自噬水平与肺癌细胞放疗敏感性，评价苦豆碱作为新的肺癌细胞自噬水平抑制剂和放疗增敏剂的可行性。本专利技术利用Beclin1、p62检测技术和荧光可视化的Ad-mRFP-GFP-LC3技术，检测苦豆碱对肺癌放疗抵抗细胞中自噬水平的影响，结果发现苦豆碱显著地抑制了细胞自噬水平，增强了肺癌细胞的放疗敏感性。本专利技术利用克隆形成实验和单击多靶模型评价肺癌细胞的放疗抗性，发现与放疗敏感细胞A549相比，放疗抵抗细胞A549/IR具有显著的放疗拮抗性。利用细胞增殖实验和克隆形成实验，分析苦豆碱对放疗抗性细胞增殖的影响，结果发现苦豆碱能够明显地抑制放疗抵抗细胞A549/IR的增值率；同时，利用流式细胞术和细胞周期检测点相关分子表达水平变化，分析苦豆碱对放疗抗性细胞周期的影响，发现苦豆碱诱导放疗抵抗细胞A549/IR发生了G1/S期细胞周期阻滞。通过苦豆碱与放疗的联合作用下，细胞增殖率的检测，发现苦豆碱能够明显增加放疗抵抗细胞A549/IR的放疗敏感性。利用Westernblot技术检测细胞自噬相关分子的变化，发现苦豆碱能够下调放疗抵抗细胞A549/IR中自噬正向调控分子Beclin1的表达、上调自噬负向调控分子p62的表达；利用电子显微镜技术检测细胞内自噬空泡的数量，发现苦豆碱明显减少了放疗抵抗细胞A549/IR中自噬空泡的数量；接着荧光显微镜评价Ad-mRFP-GFP-LC3荧光强度，发现苦豆碱能够抑制胞浆中绿色荧光信号和红色荧光信号。当苦豆碱与放疗联合作用时，上述自噬相关分子变化、自噬空泡数量的减少、LC3荧光信号减弱等变化均为最明显，提示苦豆碱改变了放疗条件下，放疗抵抗细胞A549/IR中的自噬水平，影响了放疗的效应。接下来，运用细胞自噬抑制剂氯喹、BafilomycinA1(BafA)作为阳性对照，进一步评价苦豆碱对细胞自噬的抑制作用。苦豆碱导致的放疗增敏效应与自噬抑制剂氯喹、BafA相似，即当联合放疗时，苦豆碱、氯喹、BafA均能下调Beclin1、上调p62，同时增强放疗对放疗抵抗细胞A549/IR的细胞毒效应，且联合作用更明显。总之，本专利技术的研究发现苦豆碱能够通过抑制细胞自噬水平，进而增强了肺癌细胞的放疗敏感性。自噬相关分子Beclin1、p62和荧光可视化的Ad-mRFP-GFP-LC3变化是其作用的分子基础，而细胞增殖、细胞周期、单击多靶模型等变化是其作用的重要表征。因此，肺癌细胞中自噬水平相关的生物标志物Beclin1、p62和Ad-mRFP-GFP-LC3的变化可以用来评估苦豆碱对肿瘤细胞自噬的影响，细胞增殖、细胞周期、单击多靶模型等功能试验可以用来评价苦豆碱的放疗增敏作用。附图说明图1为苦豆碱抑制肺癌放疗抵抗细胞A549/IR的增殖。A图显示不同放射剂量下，放疗敏感细胞A549、肺癌放疗抵抗细胞A549/IR的细胞克隆形成；B图单击多靶模型显示A549/IR具有明显的放疗抵抗性；C图显示苦豆碱浓度依赖性的抑制A549/IR的细胞增值率；D图显示苦豆碱抑制A549/IR的克隆形成；E图是对D图的定量分析。图2为苦豆碱导致肺癌放疗抵抗细胞A549/IR发生G1/S期阻滞。A图流式细胞术显示苦豆碱导致A549/IRG1/S期阻滞，与放疗联合作用时，阻滞效果最好；B图是对A图的定量分析；C图评价细胞周期检测点相关分子变化，显示苦豆碱抑制G1/S期细胞周期检测点分子CDK4、CKD6、CyclinD1的表达，而对G2/M期检测点CDC2的表达无影响。图3为苦豆碱增强了肺癌放疗抵抗细胞A549/IR的放疗增敏剂。A图显示苦豆碱增强了放疗对A549/IR细胞增殖抑制效应；B图显示苦豆碱增强了放疗对A549/IR细胞克隆形成能力的抑制效应；C图是对B图的定量分析。图4为苦豆碱抑制了肺癌放疗抵抗细胞A549/IR中的细胞自噬信号。A图显示苦豆碱增强了放疗对A549/IR细胞中自噬的抑制作用；B图显示氯喹增强了放疗对A549/IR细胞中自噬的抑制作用；C图显示BafA增强了放疗对A549/IR细胞中自噬的抑制作用；D图显示苦豆碱增强了放疗对A549/IR细胞中自噬空泡形成的抑制作用；E图是对D图的定量分析；F图显示苦豆碱增强了放疗对A549/IR细胞中LC3绿色荧光信号和LC3红色荧光信号的抑制作用；G-H图是对F图的定量分析。图5为抑制细胞自噬增强了肺癌细胞的放疗敏感性。A图显示与放疗联用时，苦豆碱、氯喹均下调了A549/IR细胞中自噬正向调控分子Beclin1的表达、上调自噬负向调控分子p62的表达；B图是对A图的定量分析；C图显示与放疗联用时，苦豆碱、BafA均下调了A549/IR细胞中自噬正向调控分子Beclin1的表达、上调自噬负向调本文档来自技高网...

【技术保护点】
苦豆碱用于制备肺癌放疗增敏剂。

【技术特征摘要】
1.苦豆碱用于制备肺癌放疗增敏剂。2.苦豆碱和细胞自噬抑制剂共同用于制备肺癌放疗增敏剂。3.根据权利要求2所述的细胞自噬抑制剂包括氯喹、BafilomycinA1中的一种或两种。4.苦豆碱用于制备肺癌细胞自噬抑制剂。5.评价放疗抵抗肺癌细胞自噬水平和放疗增敏效应的生物标志物，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚志成，徐志杰，颜元良，熊小明，钱龙，曾双双，戴爽，
申请(专利权)人：中南大学湘雅医院，
类型：发明
国别省市：湖南,43