定性检测ApoE基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种定性检测ApoE基因分型的焦磷酸测序引物对。所述引物对包括正向扩增引物、反向扩增引物、测序引物，所述反向扩增引物的5’端分别进行生物素标记。本发明专利技术涉及一种定性检测ApoE基因分型的焦磷酸测序试剂盒。所述试剂盒包括扩增引物、PCR反应液1、PCR反应液2、测序引物、尿嘧啶DNA糖基化酶及Taq聚合酶。本发明专利技术提供的所述试剂盒具有检测结果准确、特异性高、检测周期短、操作简单并能有效满足临床检验要求的优点；此外，还具有可实时监测反应进程、反应时间短、PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序及高通量样品检测，并比金标准方法，即毛细管电泳测序法灵敏度更高的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及体外核酸检测
，尤其涉及一种定性检测ApoE基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒。
技术介绍
载脂蛋白E(ApolipoproteinE,ApoE)是血浆中重要的载脂蛋白之一，其基因定位于第19对染色体长臂上，长37kb，其包含4个外显子和3个内含子。ApoE有三种构体(isoform)即ε2、ε3和ε4。ApoE的氨基酸序列的112位和158位两种氨基酸残基即精氨酸(Arg)和半胱氨酸(Cys)的交换决定了异构体的种类。ApoEε4在这两个位置上都是Arg；ε2都是Cys；112位为Cys和158位是Arg者为ApoEε3异构体，在自然人群中，基因频率ε3分布最高，ApoEε3/3表型分布约70％。人群中可有六种不同的表型：三种纯合子(ε2/2，ε3/3，ε4/4)和三种杂合子(ε2/3，ε2/4，ε3/4)。ApoE主要在肝脏合成、分泌和代谢。既能和存在于肝脏的ApoE受体结合，也能和遍及全身组织的载脂蛋白LDLR结合，所以可通过多种代谢途径参与机体的脂质代谢调节，成为影响机体血脂水平的重要内在因素。研究表明ApoE基因多态性可影响其与LDL受体的结合能力，突变型ε2的受体结合能力最低，进一步影响血脂代谢及其水平。同时，药物基因组学证明，ApoE基因多态性与他汀类药物的降脂疗效密切相关，他汀类药物对等位基因ε2携带者的降脂作用最强，而在ε4携带者中治疗疗效不佳。此外，有研究表明，ApoEε4等位基因与散发型阿尔茨海默病(AD)有关联，ApoEε4可能是散发性AD发病的危险因素，并建议把ApoEε4等作为散发性AD的生物标记。再者，多项研究发现ApoE基因多态性还与高脂血症、脑梗塞、冠心病和慢性乙型肝炎等疾病有着密切的关系。因此，研究和开发出高效、经济检测ApoE基因多态性的方法或试剂盒对临床医学具有深远的意义。目前从基因水平检测ApoE多态性的方法大致有以下几种，反向斑点杂交、基因芯片、Taqman-MGB双探针法等方法。中国专利CN1786188A报道了用反向斑点杂交方法检测ApoE基因型的方法，该法存在操作复杂，周期长，以及分析速度慢，容易发生PCR产物的污染出现假阳性等缺点。中国专利CN102010897A公开了一种用液相基因芯片检测ApoE多态性的方法，芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵，同样也存在操作复杂，周期长，以及分析速度慢，容易发生PCR产物的污染出现假阳性等缺点。中国专利CN101608229A公开了一种用Taqman-MGB双探针荧光PCR的方法，检测ApoE基因型，该法常常需要两条探针，而Taqman MGB探针的合成价格是普通Taqman探针的几倍，并且不能检测样本中的含量较少(≥1,000个中的1个)的等位基因或突变位点。因此，如何解决检测ApoE基因多态性存在的问题，成为亟待解决的问题。
技术实现思路
为了解决上述方法检测ApoE基因分型过程中存在敏感性不高、检测周期长、操作繁琐及成本高的技术问题，本专利技术提供一种敏感性高、特异性强、检测周期短、操作简单并有效满足临床检验要求的定性检测ApoE基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒。本专利技术提供了一种定性检测ApoE基因分型的焦磷酸测序引物对，所述ApoE基因检测的多态性位点为Cys112Arg和/或Arg158Cys，所述引物对包括：(1)对于ApoE Cys112Arg等位基因，扩增引物为：ApoE Cys112Arg正向扩增引物：5’-CCGGCTGGGCGCGGACAT-3’(SEQ ID NO.1)；ApoE Cys112Arg反向扩增引物：5’-TCGCCGCGGTACTGCACC-3’(SEQ ID NO.2)；ApoE Cys112Arg测序引物：5’-CGCGGACATGGAGGACGCG-3’(SEQ ID NO.3)；其中，所述ApoE Cys112Arg反向扩增引物的5’端进行生物素标记；(2)对于ApoE Arg158Cys等位基因，扩增引物为：ApoE Arg158Cys正向扩增引物：5’-GCTCCTCCGCGATGCCGA-3’(SEQ ID NO.4)；ApoE Arg158Cys反向扩增引物：5’-GGCCTGGTACACTGCCAG-3’(SEQ ID NO.5)；ApoE Arg158Cys测序引物：5’-GCCGATGACCTGCAGAAG-3’(SEQ ID NO.6)；其中，所述ApoE Arg158Cys反向扩增引物的5’端进行生物素标记。本专利技术还提供了一种定性检测ApoE基因分型的焦磷酸测序试剂盒，所述ApoE基因检测的多态性位点为Cys112Arg和/或Arg158Cys，所述试剂盒包括：(1)对于ApoE Cys112Arg等位基因，PCR反应液1，所述PCR反应液1含有ApoE Cys112Arg正向扩增引物：5’-CCGGCTGGGCGCGGACAT-3’；ApoE Cys112Arg反向扩增引物：5’-TCGCCGCGGTACTGCACC-3’；ApoE Cys112Arg测序引物：5’-CGCGGACATGGAGGACGCG-3’；其中，所述ApoE Cys112Arg反向扩增引物的5’端进行生物素标记；(2)对于ApoE Arg158Cys等位基因，PCR反应液2，所述PCR反应液2含有ApoE Arg158Cys正向扩增引物：5’-GCTCCTCCGCGATGCCGA-3’；ApoE Arg158Cys反向扩增引物：5’-GGCCTGGTACACTGCCAG-3’；ApoE Arg158Cys测序引物：5’-GCCGATGACCTGCAGAAG-3’；其中，所述ApoE Arg158Cys反向扩增引物的5’端进行生物素标记。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括：ApoE Cys112Arg阳性对照品1，其为插有SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的ApoE Cys112Arg野生纯合子质粒；SEQ ID NO.8：5’-CTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGG GCGCGGACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCATGCTCGGCCAGAGCAC-3′；ApoE Cys112Arg阳性对照品2，其为所述ApoE Cys112Arg野生纯合子质粒与插有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的ApoE Cys112Arg突变纯合子质粒组成的质粒混合物；ApoE Cys112Arg阳性对照品3，其为插有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的ApoE Cys112Arg突变纯合子质粒；SEQ ID NO.9：5’-CTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGG GCGCGGACATGGAGGACGTGCGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCATGCTCGGCCAGAGCAC-3’；ApoE Arg158Cys阳性对照品1，其为插有SEQ ID本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定性检测ApoE基因分型的焦磷酸测序引物对，其特征在于，所述ApoE基因检测的多态性位点为Cys112Arg和/或Arg158Cys，所述引物对包括：(1)对于ApoE Cys112Arg等位基因，扩增引物为：ApoE Cys112Arg正向扩增引物：5’‑CCGGCTGGGCGCGGACAT‑3’；ApoE Cys112Arg反向扩增引物：5’‑TCGCCGCGGTACTGCACC‑3’；ApoE Cys112Arg测序引物：5’‑CGCGGACATGGAGGACGCG‑3’；其中，所述ApoE Cys112Arg反向扩增引物的5’端进行生物素标记；(2)对于ApoE Arg158Cys等位基因，扩增引物为：ApoE Arg158Cys正向扩增引物：5’‑GCTCCTCCGCGATGCCGA‑3’；ApoE Arg158Cys反向扩增引物：5’‑GGCCTGGTACACTGCCAG‑3’；ApoE Arg158Cys测序引物：5’‑GCCGATGACCTGCAGAAG‑3’；其中，所述ApoE Arg158Cys反向扩增引物的5’端进行生物素标记。

【技术特征摘要】
1.一种定性检测ApoE基因分型的焦磷酸测序引物对，其特征在于，所述ApoE基因检测的多态性位点为Cys112Arg和/或Arg158Cys，所述引物对包括：(1)对于ApoE Cys112Arg等位基因，扩增引物为：ApoE Cys112Arg正向扩增引物：5’-CCGGCTGGGCGCGGACAT-3’；ApoE Cys112Arg反向扩增引物：5’-TCGCCGCGGTACTGCACC-3’；ApoE Cys112Arg测序引物：5’-CGCGGACATGGAGGACGCG-3’；其中，所述ApoE Cys112Arg反向扩增引物的5’端进行生物素标记；(2)对于ApoE Arg158Cys等位基因，扩增引物为：ApoE Arg158Cys正向扩增引物：5’-GCTCCTCCGCGATGCCGA-3’；ApoE Arg158Cys反向扩增引物：5’-GGCCTGGTACACTGCCAG-3’；ApoE Arg158Cys测序引物：5’-GCCGATGACCTGCAGAAG-3’；其中，所述ApoE Arg158Cys反向扩增引物的5’端进行生物素标记。2.一种定性检测ApoE基因分型的焦磷酸测序试剂盒，其特征在于，所述ApoE基因检测的多态性位点为Cys112Arg和/或Arg158Cys，所述试剂盒包括：(1)对于ApoE Cys112Arg等位基因，PCR反应液1，所述PCR反应液1含有ApoE Cys112Arg正向扩增引物：5’-CCGGCTGGGCGCGGACAT-3’；ApoE Cys112Arg反向扩增引物：5’-TCGCCGCGGTACTGCACC-3’；ApoE Cys112Arg测序引物：5’-CGCGGACATGGAGGACGCG-3’；其中，所述ApoE Cys112Arg反向扩增引物的5’端进行生物素标记；(2)对于ApoE Arg158Cys等位基因，PCR反应液2，所述PCR反应液2含有ApoE Arg158Cys正向扩增引物：5’-GCTCCTCCGCGATGCCGA-3’；ApoE Arg158Cys反向扩增引物：5’-GGCCTGGTACACTGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：滕祥云，胡玉婷，
申请(专利权)人：长沙三济生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43