检测ApoE基因多态性的引物、试剂盒及其PCR方法技术

本发明专利技术公开了一种检测ApoE基因多态性的引物、试剂盒及其PCR方法，其中包括分别检测rs429358位点和rs7412位点的两组引物；第一组引物：rs429358位点的突变型特异性上游引物、rs429358位点的野生型特异性上游引物和rs429358位点的突变型特异性上游引物与野生型特异性上游引物共用的第一下游引物；第二组引物：rs7412位点的突变型特异性上游引物、rs7412位点的野生型特异性上游引物和rs7412位点的突变型特异性上游引物与野生型特异性上游引物共用的第二下游引物；试剂盒具有检测简单、快速、准确、廉价等优点，为科研和临床ApoE基因分型和基因突变分析提供了强有力的工具。

【技术实现步骤摘要】
检测ApoE基因多态性的引物、试剂盒及其PCR方法
本专利技术涉及分子生物学基因检测领域，特别提供了检测ApoE基因多态性的引物、试剂盒及其PCR方法，用于ApoE基因rs429358和rs7412两个多态位点的快速检测。
技术介绍
ApoE基因与多种心脑血管疾病密切相关，其编码的载脂蛋白E（ApolipoproteinE，ApoE）参与高血脂症、动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病的整个发生发展过程，ApoE基因多态性是这些疾病早期及发展过程中个体差异的主要原因。ApoE的氨基酸序列的112位和158位两种氨基酸残基即精氨酸(Arg)和半胱氨酸(Cys)的交换决定了异构体的种类。ApoE基因有3种异构体，分别为ApoE2、ApoE3和ApoE4，其中ApoE3在中国人群中分布比较广泛，所占比例约为60%~70%，也可称为正常基因。每一个等位基因对应于一个主要异构体产生三种纯合子(E2/E2，E3/E3，E4/E4)和三种杂合子(E2/E3，E2/E4，E3/E4)共六种常见表型。ApoE基因具有异构体特异性，即不同基因编码的蛋白质功能具有差异性，从而导致不同蛋白质对脂质的代谢能力不同、抗氧化及抗炎症能力不同。ApoE基因多态性是冠心病（CHD）早期及发展过程中个体差异的主要原因，通过ApoE基因多态性的检测可以了解个体CHD及心肌梗塞（MI）的易感性。ApoE2的作用是降低胆固醇浓度，对冠状动脉硬化的发展有一定的防护作用，而ApoE4则会使血浆LDL-C、TC浓度升高，易诱发CHD及MI。另外国内外多项研究发现，ApoE基因是目前已知的阿尔茨海默病最密切的遗传标志物，ApoE4携带者阿尔茨海默病的易感性增加。目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有直接测序法；基因芯片杂交法；PCR-RFLP方法；PCR扩增产物毛细管电泳分析法；PCR-SSCP；PCR高分辨熔解曲线分析技术；PCR-TaqmanMGB（MinorGrooveBinder）探针法；AS-PCR法；Cast-PCR法等。这些方法或多或少还存在仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等缺点。如：1）直接测序法是突变分析的金标准，能发现已知和未知突变位点，但该法检测基因突变的灵敏度为20%（即目的基因的突变基因DNA模板数占野生型DNA模板数的20%）。同时还存在操作复杂，周期长，分析速度慢，常需要2天的时间，而且该法是开管操作，大大增加污染的可能性，不适合对大规模标本的检测，同时还需要昂贵的仪器，存在在基层不易实施等缺点。2）普通PCR-RFLP方法技术简便，价格便宜，适宜少量样本的实验室检测，但RFLP仅能检测有酶切位点的突变，无酶切位点不能检测，费时费力，还存在PCR产物污染导致假阳性的风险，见[MolDiagnTher.2010Jun1;14(3):163-9,UnitedStatesPatent20120135406]。3）芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。4）PCR高分辨熔解曲线分析技术，能高通量检测基因的突变情况，试剂成本较低，但因其荧光信号来自染料，特异性受到影响，而且检测仪器是升级版的荧光PCR仪，价格高昂，普及受限，见[ClinChimACqa.2012Nov12;413(21-22):1781-5;UnitedStatesPatent20110045479]。5）PCR-TaqmanMGB探针法适合已知突变位点，常常需要两条探针，而TaqmanMGB探针的合成价格是普通Taqman探针的几倍，见[JClinMicrobiol.2010Aug;48(8):2909-15；UnitedStatesPatent20090311679]，并且不能检测样本中的含量较少(≥1,000个中的1个)的等位基因或突变位点。6）PCR-SSCP法虽然简单，但该法是开放性的检测系统，容易造成PCR产物的污染，而且操作步骤多，费时费力。7）等位基因特异性引物PCR扩增法(AS-PCR)，这一方法是目前检测基因突变或SNP最简单快速的方法（WuDY,UgozzoliL,PalBK,WallaceRB.,ProcNatlAcadSciUSA1989;86:2757-2760)，其原理是引物3'末端碱基与模板的碱基错配，其PCR的效率将会下降103-106.6倍(Chen,X.,andSullivan,PF,ThePharmacogeonomicsJournal2003,3,77-96)。尽管该方法的原理简单，但错配的引物，依然会发生非特异性扩增，扩增情况视突变的类型和检测位点周围的碱基序列相关(AyyadevaraS,ThadenJJ,ShmooklerReisRJ.,AnalBiochem2000;284:11-18)，还与样本中存在的等位基因变量的影响。为了增加AS-PCR的特异性，许多科学家做了很多努力。大量的实验证明，该方法最关键的是设计与3'末端突变位点碱基互补或错配的两条特异引物，引物设计不好，将导致高背景的交叉扩增，会导致较高的假阳性。尽管不少人努力将这一弊端克服，如报道的TaqMAMA方法，在3’倒数第二位或第三位上引入突变碱基，的确可以增加反应的特异性，但仍然无法完全消除假阳性，而且在纯合子与杂合子的判断上，缺乏标准，会出现混乱的情况，见[JVirolMethods.2008Nov;153(2):156-62;Genomics.2004Feb;83(2):311-20]。简单的AS-PCR，通常采用PCR反应结束后再进行电泳，从有无反应条带来判断结果，这种方法虽然不需要昂贵的仪器，但电泳操作，增加了PCR的污染机会，而且耗时费力。尽管有人对该方法作了改进，采用荧光定量PCR技术，但得到的不是“全或无”式的结果，总会有非特异性反应的发生，即同样的引物对野生型和突变型位点都会扩增，只是其得到的Ct（Cyclethreshold）不同而已，因此就引入了ΔCt的概念，即ΔCt=野生Ct-突变Ct，但计算复杂，如要ΔCt值大于纯合子Ct值判为突变型纯合子，ΔCt值小于杂合子Ct值，判为杂合子，ΔCt值的引入不仅增加了操作步骤，还会引起混乱，因为ΔCt值的设定标准无法准确定位，不同人员的操作、不同的标本和不同的检测仪器都会有不同的数字，给临床应用带来很大的困难，实际应用依然受限，见[中国专利CN101235415，CN101565742A]。8）美国LIFE公司采用一种MGB封闭探针的方法，称作Cast-PCR（CompetitiveallelespecificTaqmanPCR），用MGB探针将不检测的位点封闭，然后用等位基因特异引物荧光定量PCR的方法检测目的位点，这虽然提高了检测的特异性，但由于多加入一条MGB封闭探针，势必增加成本，对反应效率多少会带来干扰，见[ExpMolPathol.2012Jun;92(3):275-80；UnitedStatesPatent20100221717；CN102428190A]。有人采用锁核酸(LNA)(PlantMet本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测ApoE基因多态性的引物，其特征在于，所述引物包括分别检测rs429358位点和rs7412位点的两组引物；第一组引物：rs429358位点的突变型特异性上游引物、rs429358位点的野生型特异性上游引物和rs429358位点的突变型特异性上游引物与野生型特异性上游引物共用的第一下游引物，且所述rs429358位点的突变型特异性上游引物具有SEQ No.21序列，所述rs429358位点的野生型特异性上游引物具有SEQ No.24序列，所述共用的第一下游引物具有SEQ No.23序列；第二组引物：rs7412位点的突变型特异性上游引物、rs7412位点的野生型特异性上游引物和rs7412位点的突变型特异性上游引物与野生型特异性上游引物共用的第二下游引物，且所述rs7412位点的突变型特异性上游引物具有SEQ No.29序列，所述rs7412位点的野生型特异性上游引物具有SEQ No.32序列，所述共用的第二下游引物具有SEQ No.30序列。

【技术特征摘要】
1.一种检测ApoE基因多态性的引物，其特征在于，所述引物包括分别检测rs429358位点和rs7412位点的两组引物；第一组引物：rs429358位点的突变型特异性上游引物、rs429358位点的野生型特异性上游引物和rs429358位点的突变型特异性上游引物与野生型特异性上游引物共用的第一下游引物，且所述rs429358位点的突变型特异性上游引物序列如SEQNo.21所示，所述rs429358位点的野生型特异性上游引物序列如SEQNo.24所示，所述共用的第一下游引物序列如SEQNo.23所示；第二组引物：rs7412位点的突变型特异性上游引物、rs7412位点的野生型特异性上游引物和rs7412位点的突变型特异性上游引物与野生型特异性上游引物共用的第二下游引物，且所述rs7412位点的突变型特异性上游引物序列如SEQNo.29所示，所述rs7412位点的野生型特异性上游引物序列如SEQNo.32所示，所述共用的第二下游引物序列如SEQNo.30所示。2.一种检测ApoE基因多态性的试剂，其特征在于：所述试剂含有权利要求1所述的引物。3.一种检测ApoE基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1所述的引物。4.按照权利要求3所述检测ApoE基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括分别与权利要求1所述第一组引物和第二组引物配合使用的第一探针和第二探针，且所述第一探针和第二探针均为Taqman探针，其中，所述第一探针序列如SEQNo.22所示，所述第二探针序列如SEQNo.31所示。5.按照权利要求4所述检测ApoE基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR反应管、dNTPs和Taq酶混合液、PCR缓冲液、检测管家基因GAPDH的上游引物、检测管家基因GAPDH的下游引物、检测管家基因GAPDH的探针、阳性质控品和空白对照；所述检测管家基因GAPDH的上游引物序列如SEQNo.26所示；所述检测管家基因GAPDH的下游引物序列如SEQNo.27所示；所述检测管家基因GAPDH的探针序列如SEQNo.28所示。6.按照权利要求5所述检测ApoE基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述rs429358位点的突变型特异性上游引物、所述共用的第一下游引物、所述第一探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针被预先包被于第一C型PCR反应管内；所述rs429358位点的野生型特异性上游引物、所述共用的第一下游引物、所述第一探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针被预先包被于第一T型PCR反应管内；所述rs7412位点的突变型特异性上游引物、所述共用的第二下游引物、所述第二探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针被预先包被于第二T型PCR反应管内；所述rs7412位点的野生型特异性上游引物、所述共用的第二下游引物、所述第二探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GA...

【专利技术属性】
技术研发人员：高劲松，张英杰，李星颐，刘会影，魏潇，魏奇，
申请(专利权)人：沈阳优吉诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21