用于核酸测序的组合物和方法包含模板构建物，部分或完全连续构建物中包含双链部分，用于通过正义链和反义链中的一条链或两条链的测序来确定丰余序列以及多次重复测定完整构建物的序列。可选的是，其他的序列组分也可以包含在这种模板构建物内。本发明专利技术还提供了这些构建物以及这些应用所需的测序组合物的使用和制备方法。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】 本申请是国际申请PCT/US2009/001926,国际申请日2009年3月27日，中国国家 阶段申请号200980115750. 0的专利技术专利申请的分案申请。 相关申请的交叉参考 本申请要求如下美国临时专利申请的权益：美国临时专利申请系列号 61/072, 160,申请日2008年3月28日，以及美国临时专利申请系列号61/099, 696,申请日 2008年9月24日，其内容已完整纳入本文作为参考。 本申请还涉及美国临时专利申请系列号61/139, 402,申请日2008年12月19 日，美国专利申请系列号，申请日2009年3月27日（代理人备案系列号 01-007701)和美国专利申请系列号，申请日2009年3月27日（代理人备案系 列号01-005902)，其完整内容已纳入本文作为参考。 有关联邦资助的研宄的权利声明 无 专利技术背景 遗传密码是所有生命构架的蓝图，对遗传密码了解的能力已经在无数领域产生了 巨大的进步。从诊断疾病的能力到鉴定进化联系和/或多样性的能力、操作遗传框架开发 新材料和组合物的能力，这种了解为我们取得不可胜数的进展开启了大门，这些进展已经 使人类获益良多，并且将继续受益。 这些进步就整体而言是涉及阅读遗传密码和/或确定遗传密码特征的技术方面 的进步。例如，核酸测序技术的开发使我们能够以逐个碱基的方式确定核酸序列，并将遗传 密码定位到整个人类基因组上。其他方面的进展包括以快速阵列为基础的技术，该技术可 以使我们更合理地确定患者或其他生物样本的遗传模式。 每一个技术进步都使我们有机会通过与那些先进领域有关的相关或辅助技术进 一步提高技术水平。例如，荧光染料化学的进展促进了遗传技术的许多进步，使我们能够对 生物反应及其产物进行简单的分析。另外，微流体技术的开发提高了液体和试剂操作的水 平，其达到的重复性水平是以前通过更常规的方式所无法达到的。 本专利技术涉及遗传分析中所用的改良工艺、系统和组合物，这些工艺、系统和组合物 可以提高这些分析的精确度并使之更便于使用。 专利技术概述 本专利技术提供了改良的核酸模板构建物、组合物、试剂盒和包含这种构建物的系统 以及制备和使用这种构建物的方法。 在第一方面，本专利技术提供了确定模板核酸区段中所含的共有核苷酸序列的方法。 该方法包括在一个毗连核酸分子中提供模板核酸区段的正义和反义链。然后利用聚合酶介 导的模板依赖的测序方法测定正义和反义链的序列，进而根据正义和反义链的序列确定靶 核酸区段的共有序列。 在一个相关方面，本专利技术提供了测定核酸序列的方法，该方法包括提供一个包含 具有第一和第二末端的双链核酸区段的模板核酸。第一发卡寡核苷酸在第一末端与模板核 酸的两条链相连，第二发卡寡核苷酸在第二末端与模板核酸的两条链相连。然后利用模板 指导的聚合酶介导的核酸测序方法测定模板核酸至少一条链的核苷酸序列。 在另一方面，本专利技术提供了测定核酸序列的方法，该方法包括提供一个包含具有 第一和第二末端的双链核酸区段的模板核酸，其中第一发卡寡核苷酸在第一末端与模板核 酸的两条链相连，然后利用模板指导的聚合酶介导的核酸测序方法测定模板核酸的核苷酸 序列。 在其他方面，本专利技术提供了测定核酸区段序列的方法，该方法包括提供一个模板 核酸区段。片段包含第一和第二互补核酸链，第一链将连接第一核酸区段3'端的核酸连接 到第二核酸区段的5'端，第二链将连接第一核酸链5'端的核酸连接到第二核酸链的3'端。 然后模板核酸与引物序列接触，其中引物序列与模板核酸的至少一部分互补。然后通过监 测模板依赖的引物延伸反应确定模板核酸的核苷酸序列。 在另一方面，本专利技术提供了测定核酸序列的方法，该方法包括提供一个包含双链 区段的模板核酸，其中双链区段包含第一和第二互补链以及至少一个将第一链3'端连接到 第二链的5'端的第一单链寡核苷酸区段；以及监测模板依赖的合成反应过程中掺入的核 苷酸来测定第一链、连接寡核苷酸区段和第二链的核苷酸序列。 在其他优选方面，在上述一个或多个类似寡核苷酸或发卡寡核苷酸内提供对照序 列，如引物识别序列等。 在相关的方面，本专利技术提供了测定模板核酸区段的共有核酸序列的方法，其中在 一个毗连核酸分子内提供模板核酸区段的正义和反义链。毗连核酸分子与引物序列接触和 /或形成复合物，其中引物序列与毗连核酸分子的至少一部分互补，在聚合酶、多种核苷酸 或核苷酸类似物存在的情况下形成核苷酸合成复合体，其中各个核酸合成复合体被沉淀到 底物上，这样就可以通过光学方法测定各个复合体。然后监测和/或检测核酸合成反应中 被各个复合体以模板依赖的方式掺入的核苷酸或核苷酸类似物的序列以确定正义和反义 链的核酸序列。然后利用或比较正义和反义链的核酸序列以确定模板核酸的共有序列。 本专利技术还提供了混合样品测定方法。例如，在某些方面，本专利技术的方法包括从一群 不连续核酸样品的每一个样品中制备模板核酸区段，其中模板核酸区段包含核酸样品的双 链区段，双链区段的第一链通过连接寡核苷酸与双链区段的第二链连接，其中每一个不连 续核酸样品的连接寡核苷酸都具有独特的可鉴定的序列特征。然后将来自于一群不连续核 酸样品的模板核酸区段混合在一起，测定混合的模板核酸区段的序列以确定可鉴定的序列 特征，根据测序步骤鉴定的至少一部分独特的可鉴定序列特征就可以确定来自于不连续核 酸样品的核酸的序列。 本专利技术还涉及用于上述方法的组合物。在一个方面，本专利技术提供了包含模板核酸 和至少一个第一连接寡核苷酸区段的组合物，其中模板核酸具有包含第一链区段和与第一 链区段基本互补的第二链区段的双链核酸区段，第一连接寡核苷酸区段将第一链区段的3' 端与第二链区段的5'端连接起来。组合物通常还包含能与模板核酸的至少一部分杂交并 启动聚合酶介导的核酸合成的一个或多个引物序列以及聚合酶。 本专利技术还提供了用于实现本专利技术方法的模板制备试剂盒。这种试剂盒通常包含第 一连接寡核苷酸、与第一连接寡核苷酸的至少一部分互补的引物序列以及用于将第一连接 寡核苷酸连接到双链模板第一链的3'端和双链模板第二链的5'端的一种或多种连接试 剂。另外，这种试剂盒通常还包含说明书以及可选的用于将连接寡核苷酸连接到待分析样 品来源的双链靶核酸区段上的试剂。 本专利技术还包括用于测定核酸模板序列的系统。系统通常包括反应混合物，该混合 物包含含有模板核酸、聚合酶以及与模板序列的至少一部分互补的引物序列的复合物，其 中模板序列包含具有正义和反义链的双链区段，以及将正义链的5'端连接到反义链的3' 端上的至少一个第一连接寡核苷酸，包含可检测标记基团的至少一个第一核苷酸或核苷酸 类似物，以及用于检测第一核苷酸或核苷酸类似物被聚合酶掺入到引物延伸产物内的检测 系统， 尽管为了说明对本专利技术作了相对详细的描述，但是应当理解的是，本专利技术的各种 变体在本专利技术的范围内也可以实现。 附图简述 图IA以示意图的形式描述了单分子实时测序过程。图IB说明的是通过图IA所 示的过程进行序列阅读的典型短片段。 图2说明的是用于本专利技术的模板构建物的两个典型实施方式。 图3以示意图的形式描述了利用图2所示的构建物进行的丰富或共有序列测序过 程。 图4说明的是其他模板构建物及其在测序过程中的应用。 图5以示意图的形式描述了本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测序方法，包括：提供线性双链核酸分子，其中线性双链部分包含双链核酸区段的正向链和反向链，所述正向链与所述反向链彼此互补；将正向链的3'端与反向链的5'端连接，由此形成测序模板，所述正向链的3'端与所述反向链的5'端通过连接寡核苷酸相连；对所述测序模板进行单分子测序，由此获得所述测序模板的序列数据，所述序列数据包含所述测序模板的正向链序列和反向链序列；通过分析所述序列数据确定所述线性双链核酸分子的序列。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：K·特拉弗斯，G·奥托，S·特纳，C·海纳，C·马，
申请(专利权)人：加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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