本发明专利技术公开了一种检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的引物、试剂盒及其PCR方法，其中包括：野生型特异性上游引物、突变型特异性上游引物和野生型特异性上游引物与突变型特异性上游引物共用的下游引物；且所述野生型特异性上游引物具有SEQ No.17序列，所述突变型特异性上游引物具有SEQ No.14序列，所述共用的下游引物具有SEQ No.16序列；试剂盒具有检测简单、快速、准确、廉价等优点，为科研和临床乙醛脱氢酶2基因型和基因突变分析提供了强有力的工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学基因检测领域，特别提供了一种检测乙醛脱氢酶2基因多 态性的引物、试剂盒及其PCR方法，用于乙醛脱氢酶2基因 rs671多态位点的快速检测。
技术介绍
有机硝酸酯类药物用于治疗心绞痛是通过释放一氧化氮（NO)介导的，乙醛脱氢 酶2 (ALDH2)具有硝酸酯酶活性，可以将有机硝酸酯脱硝形成一氧化氮，是有机硝酸酯药物 发挥疗效的关键。如果病人ALDH2基因中携带有Glu504Lys (rs671)突变，变异基因编码 的蛋白质结构具有差异，ALDH2的硝酸酯酶活性会降低10倍以上，突变型ALDH2 *2/2是 野生型ALDH2*1/1活性的6 - 7%，突变型ALDH2*l/2是野生型ALDH2*1/1活性的8 - 15%， 因此ALDH2突变型酶Lys504不能迅速将有机硝酸酯转化为N0,导致心肌缺血情况加重，难 以发挥药效。资料显示，亚洲人群约5%-30%的个体都携带有ALDH2*2/2或ALDH2*l/2突 变。对于携带突变基因型(风险基因型）的患者，则不能完全把有机硝酸酯类药物当作心绞 痛发作时的唯一药品，因此，本试剂盒的适用人群为预期使用有机硝酸酯类药物的患者，检 测ALDH2基因型可预知含服有机硝酸酯类药物的风险，为医生合理使用有机硝酸酯类药物 提供参考。 此外，ALDH2基因的rs671 G > A型突变，直接导致ALDH2在乙醇代谢途径中乙醛 脱氢成乙酸时活性的大幅度下降，使饮酒者体内乙醛大量储积，乙醛的毒性会使饮者头痛， 全身发红，加重肝脏负担。科学研宄发现这种突变还会增加人体患多种肿瘤尤其是食道癌 的风险，因此，本试剂盒还可适用于了解酒精代谢能力及酒精对身体危害程度的人群。 目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有直接测序法；基因芯片杂交法； PCR-RFLP方法；PCR扩增产物毛细管电泳分析法；PCR-SSCP ;PCR高分辨熔解曲线分析技 术；PCR-Taqman MGB (Minor Groove Binder)探针法；AS-PCR 法；Cast-PCR 法等。这些方 法或多或少还存在仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床 普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等缺点。 如：1)直接测序法是突变分析的金标准，能发现已知和未知突变位点，但该法检测 基因突变的灵敏度为20%(即目的基因的突变基因 DNA模板数占野生型DNA模板数的20%)。 同时还存在操作复杂，周期长，分析速度慢，常需要2天的时间，而且该法是开管操作，大大 增加污染的可能性，不适合对大规模标本的检测，同时还需要昂贵的仪器，存在在基层不易 实施等缺点。 2)普通PCR-RFLP方法技术简便，价格便宜，适宜少量样本的实验室检测，但RFLP 仅能检测有酶切位点的突变，无酶切位点不能检测，费时费力，还存在PCR产物污染导致 假阳性的风险，见。 3)芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用 于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。 4) PCR高分辨熔解曲线分析技术，能高通量检测基因的突变情况，试剂成本较低， 但因其荧光信号来自染料，特异性受到影响，而且检测仪器是升级版的荧光PCR仪，价格高 昂，普及受限，见〇 5 ) PCR-Taqman MGB探针法适合已知突变位点，常常需要两条探针，而Taqman MGB探针的合成价格是普通Taqman探针的几倍，见，并且不能检测样本中的含量 较少（彡1，〇〇〇个中的1个）的等位基因或突变位点。 6)PCR-SSCP法虽然简单，但该法是开放性的检测系统，容易造成PCR产物的污染， 而且操作步骤多，费时费力。 7)等位基因特异性引物PCR扩增法（AS-PCR)，这一方法是目前检测基因突变或 SNP最简单快速的方法（Wu D Y, Ugozzoli L, Pal B K, Wallace R B·，Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86:2757-2760)，其原理是引物3'末端碱基与模板的碱基错配，其PCR的 效率将会下降 IO3-IO6.6倍（Chen, X·，and Sullivan, P F, The Pharmacogeonomics Journal 2003，3，77-96)。尽管该方法的原理简单，但错配的引物，依然会发生非特异 性扩增，扩增情况视突变的类型和检测位点周围的碱基序列相关（Ayyadevara S, Thaden J J, Shmookler Reis R J·, Anal Biochem 2000; 284:11-18)，还与样本中存在的等位 基因变量的影响。为了增加 AS-PCR的特异性，许多科学家做了很多努力。大量的实验证 明，该方法最关键的是设计与3'末端突变位点碱基互补或错配的两条特异引物，引物设 计不好，将导致高背景的交叉扩增，会导致较高的假阳性。尽管不少人努力将这一弊端克 月艮，如报道的TaqMAMA方法，在3'倒数第二位或第三位上引入突变碱基，的确可以增加 反应的特异性，但仍然无法完全消除假阳性，而且在纯合子与杂合子的判断上，缺乏标准， 会出现混乱的情况，见。简单的AS-PCR，通常采用PCR反应结束后再进行电泳，从有无反应 条带来判断结果，这种方法虽然不需要昂贵的仪器，但电泳操作，增加了 PCR的污染机会， 而且耗时费力。尽管有人对该方法作了改进，采用荧光定量PCR技术，但得到的不是"全或 无"式的结果，总会有非特异性反应的发生，即同样的引物对野生型和突变型位点都会扩 增，只是其得到的Ct (Cycle threshold)不同而已，因此就引入了 ACt的概念，即ACt= 野生Ct-突变Ct，但计算复杂，如要Λ Ct值大于纯合子Ct值判为突变型纯合子，Λ Ct值 小于杂合子Ct值，判为杂合子，ACt值的引入不仅增加了操作步骤，还会引起混乱，因为 ACt值的设定标准无法准确定位，不同人员的操作、不同的标本和不同的检测仪器都会有 不同的数字，给临床应用带来很大的困难，实际应用依然受限，见〇 8)美国LIFE公司采用一种MGB封闭探针的方法，称作Cast-PCR ( Competitive allele specific Taqman PCR)，用MGB探针将不检测的位点封闭，然后用等位基因特异 引物荧光定量PCR的方法检测目的位点，这虽然提高了检测的特异性，但由于多加入一 条MGB封闭探针，势必增加成本，对反应效率多少会带来干扰，见。有人采用锁 核酸（LNA) ( Plant Method 2007, 3 :2)或修饰的碱基（Anal Biochem. 2005, 340 :287-294) 的PCR引物，可以使得AS-PCR检测灵敏度提高。然而，这些方法增加了分析的总体成本，并 需对反应进行深度优化。 目前，国内已上市有注册证的ALDH2基因检测试剂盒有如下一种：上海百傲科技 有限公司的"ALDH2(Glu504Lys)基因检测试剂盒（DNA微阵列芯片法）"，国食药监械（准） 字 2013 第 3400244 号。 国内广州达健生物科技有限公司申请的一种ALDH2基因的rs671基因突变荧本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测乙醛脱氢酶2基因rs671多态性位点的引物，其特征在于，所述引物包括：野生型特异性上游引物、突变型特异性上游引物和野生型特异性上游引物与突变型特异性上游引物共用的下游引物；且所述野生型特异性上游引物具有SEQ No.17序列，所述突变型特异性上游引物具有SEQ No.14序列，所述共用的下游引物具有SEQ No.16序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高劲松，张英杰，李星颐，樊志美，于农，魏潇，魏奇，
申请(专利权)人：沈阳优吉诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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