本发明专利技术提供一种NRAS基因突变检测试剂盒，包括：（1）用于扩增样本中NRAS基因Exon2、3和4三个外显子的特异性引物，引物序列分别是SEQ ID Nos：1‑6；（2）用于测序PCR的测序引物，分别用于对NRAS基因2、3和4三个外显子进行测序分析，引物序列分别是SEQ ID Nos：7‑9；（3）3个装有NRAS野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管。本试剂盒不同外显子的PCR扩增条件一致，且能在样本浓度较低时检测到目的基因，结果无非特异性扩增。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种试剂盒，具体涉及一种肿瘤相关基因NRAS基因突变检测试剂盒。
技术介绍
NRAS基因是RAS癌基因家族的成员，定位于1号染色体，基因全长85kb，哺乳动物RAS基因家族包括c-Hras1、c-K-ras2及N-ras基因。ras基因家族编码含188-189个氨基酸残基，分子量为21KD的蛋白即P21蛋白，其氨基酸序列高度保守，仅有C末端40个氨基酸的差异。RAS蛋白具有GTP/GDP结合的能力及GTP酶活性，它们的正常功能为G蛋白类似的调节蛋白，具有从膜结合受体到腺苷酸环化过程的信号传导作用，参与细胞周期的正常调控。RAS基因活化主要是通过（1）编码区内的点突变；（2）插入激活；突变激活RAS基因家族主要是以点突变为主。突变的RAS蛋白失去内在的GTP酶活性使ras蛋白维持于活化状态，不断激活靶分子，引起信号传导的持续效应，导致细胞大量增殖，从而发生恶性转化。目前研究表明，N-ras基因突变在ras基因突变中出现的频率最高，以第12、13、61或146密码子突变最为常见，其常见突变位点有Codon12:G12A,G12C,G12D,G12R,G12S,G12V；Codon13:G13A,G13C,G13D,G13R,G13S,G13V；Codon61:Q61E,Q61H,Q61K,Q61L,Q61P,Q61R；Condon146：A146K。N-ras突变主要发生于骨髓增生异常综合症（MDS)、黑色素瘤、肝癌、急性髓系白血病（AML）等。国外研究发现RAS基因突变在MDS检出率可达20%-50%不等，ras基因突变与MDS预后的关系密切相关，这种预后关系现在研究倾向与该基因突变与MDS进展为AML密切相关，基因突变导致基因组的不稳定，导致预后差及生存期短。PaduaRA,GuinnBA10等通过对75名MDS患者进行10年随访研究发现ras基因突变率为36%，携带ras基因突变者向急性白血病转化的风险较阴性者显著提高。FernandezT等采用聚合酶链反应-寡核苷酸探针杂交技术分析了巴西人群50例MDS患者发现21例患者存在N-ras基因点突变（42%），其中9例发展为急性白血病，对N-ras基因点突变和染色体异常相关性分析发现8号染色体三体可能和N-ras基因点突变相关，这部分病人在随访过程中均进展为急性髓系白血病。FenauxP等认为10%的MDS患者在诊断初即可表现为N-ras基因突变阳性，30%-40%的患者随着疾病进展出现N-ras基因突变。N-ras基因在恶性黑色素瘤中的突变率为13%-25%，NRAS基因与黑色素瘤细胞增殖的相关性，随着黑色素瘤细胞的增殖，细胞内NRASmRNA和蛋白表达量均显著提高。研究证明携带N-ras或V600BRAF基因突变的晚期黑色素瘤患者可以从BRAF抑制剂治疗中获益。然而，对于BRAF野生型肿瘤患者（包括携带NRAS变异基因的患者）来说就不存在靶向治疗。意大利国立肿瘤研究机构的PaoloAAscierto等针对上述问题进行了相关研究，他们的Ⅱ期临床试验研究发现，对于N-ras基因变异的黑色素瘤患者，一种小分子MEK1/2抑制剂——MEK162是第一个有效的靶向治疗药物，且可能为几乎无有效治疗方法的癌症患者提供一种新的治疗选择。NRAS基因突变的检测主要有Sanger测序法、ARMS、RT-PCR等。其中RT-PCR技术采用等位基因特异性扩增法对样本的基因突变进行区分，该方法成本较低，但检测率较高，容易出现假阴性结果；ARMS技术是目前国内应用最为广泛的技术，但只能检测已知的位点，且要将样本分成多个管进行实验才能实现分型，对样本量要求高；而Sanger测序法是DNA序列分析的经典方法，最直接的、可检测已知和未知突变的一种方法。由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的金标准，其主要优点是测序长度较长，可发现新的变异位点，包括一些新的少见的突变形式及突变的确切类型，如点突变、片段缺失。所以探索一种Sanger测序法检测NRAS基因的技术具有重要的临床意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述问题，提供一种NRAS基因突变检测试剂盒，可直接利用含人体某组织部位的石蜡包埋样本通过Sanger测序法检测出样本中NRAS基因主要突变位点型别，检测位点包括NRAS基因2、3和4三个外显子的主要突变位点，包括但不限于2号外显子上c.34G>A，p.G12S突变位点；3号外显子上c.181C>A，p.Q61K突变位点；4号外显子上c.436G>A，p.A146T突变位点。本专利技术的NRAS基因突变检测试剂盒具体包括：（1）用于扩增样本中NRAS基因Exon2、3和4三个外显子的特异性引物，具体序列如下:（2）用于测序PCR的测序引物，分别用于对NRAS基因2、3和4三个外显子进行测序分析，具体序列如下：外显子名称序列号Reverse5’-3’2SEQ-N2SEQIDNo.7TAGATGTGGCTCGCCAATTAAC3SEQ-N3SEQIDNo.8TGCATTCCCTGTGGTTTTTAAT4SEQ-N4SEQIDNo.9CCCAGCCTAATCTTGTTTTTCT（3）3个装有NRAS野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管；其中突变型质粒分别是2号外显子上c.34G>A，p.G12S突变位点；3号外显子上c.181C>A，p.Q61K突变位点；4号外显子c.436G>A，p.A146T突变位点；PCR反应预混液由以下组份组成：组份体积（μl）10PCRbuffer2.55Qsolution525mMMgCl21.525mMdNTPs0.4H2O10.35其中10×PCRbuffer中含有500mMKCl，100mMTris-HCl(pH8.3)，100mM(NH4)2SO4，和15mMMgCl2；5×Qsolution中含有1MTricine[pH8.7(withKOH)]，8%(v/v)Glycerol和5%(v/v)DMSO；25mMdNTPs中含有25mMdATPs、25mMdTTPs、25mMdCTPs和25mMdGTPs。本试剂盒主是根据NRAS基因2、3和4三个外显子的保守序列分别设计NRAS基因三个外显子的特异性引物，分别将Exon2、3和4三个外显子使用PCR的方法进行扩增，纯化回收扩增产物。本专利技术的各种引物长度在20-25个碱基之间，无特殊修饰。反应液预混液采用独特的配方及比例。不同外显子的PCR扩增条件一致，且能在样本浓度较低时检测到目的基因，结果无非特异性扩增。具体操作流程包括：（1）引物设计：利用引物设计软件，如PrimerPremier5，从NRAS基因DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计NRAS基因2、3和4三个外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA。测序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一段即可，引物序列分别是SEQIDNOs：1-9。长度在20-25个碱基左右（2）PCR扩增：利用试剂盒中含特定序列的引物PCR扩增临床样本中的DNA。（3）琼脂糖凝本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于NRAS基因突变检测的Exon2、3和4三个外显子的引物，引物序列分别是SEQ ID Nos：1‑9。
【技术特征摘要】
1.用于NRAS基因突变检测的Exon2、3和4三个外显子的引物，引物序列分别是SEQIDNos：1-9。2.NRAS基因突变检测试剂盒，包括：（1）用于扩增样本中NRAS基因Exon2、3和4三个外显子的特异性引物，引物序列分别是SEQIDNos：1-6；（2）用于测序PCR的测序引物，分别用于对NRAS基因2、3和4三个外显子进行测序分析，引物序列分别是SEQIDNos：7-9；（3）3个装有NRAS野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管；其中突变型质粒分别是2号外显子上c.34G>A，p.G12S突变位点；3号外显子上c.181C>A，p.Q61K突变位点；4号外显...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈俊飞，郑焱，陈佩璇，徐锋，谢龙旭，
申请(专利权)人：广州凯普医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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