一种鉴定普通菜豆种质起源的引物及方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定普通菜豆种质起源的引物及方法，引物包括：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；方法包括模板基因组DNA提取与稀释；引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的合成与稀释；PCR仪的选择与扩增；PCR扩增产物电泳；PCR扩增产物检测。本发明专利技术很方便的鉴定出该材料的基因库类型，分别用本发明专利技术的标记和30对SSR标记对223份普通菜豆材料进行分类；标记的分类结果正确率为97.3，SSR的分类结果的正确率为91.5％。本发明专利技术的引物对组成的分子标记属于单基因插入缺失标记，具有遗传稳定性强，不易变异的特点，且在使用中容易观察，不同起源的材料具有明显的标记类型。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，尤其涉及一种鉴定普通菜豆种质起源的引物及方法。
技术介绍
普通菜豆，又称有四季豆、芸豆等，学名PhaseolusvulgarisL.，英文名为commonbean。普通菜豆染色体2n＝22，属于豆科(Leguminosae)，蝶形花亚科(Papilionoideae)，菜豆族(Phaseoleae)，菜豆属(Phaseolus)，菜豆种(PhaseolusvulgarisL.)(郑卓杰，1995)。普通菜豆是7000-8000年前从位于高原地带的中美洲和安第斯山的野生类型进化而来(Gepts和Debouck，1991)，它的训化分别从安第斯和中美洲两个起源中心开始，因此也就形成了现在的两大基因库即安第斯基因库(Andeangenepool)和中美洲基因库(MiddleAmericangenepool)。这两大基因库的材料在植株高度、籽粒大小、单株产量、抗逆性方面存在显著差异。由于起源不同，两大基因库材料之间进化形成了各自显著的特征，中美洲基因库由其特征是种子为中小型(百粒重为25～40g)，表皮有花斑、粉色、白色和黑色，部分荚用菜豆(snapbean)来源于该基因库；安第斯基因库其特征是种子比较大(百粒重大于40g)，以肾形为主，大部分荚用菜豆来源于该基因库(Broughton等，2003；McClean等，2004；Vanderborght，1982)。作物杂交育种是选育新品种的主要手段，两个亲本的遗传互补性越强，获得的优良杂交品种的几率越高。因此，开始进行普通菜豆杂交育种前首先需要弄清楚亲本的遗传背景和起源。普通菜豆是人类主要的食用豆类作物，占全球食用豆类总产量的50％，是人类植物蛋白的主要来源之一。选择遗传背景差异大的亲本进行杂交，选育新育种是改良现有普通菜豆品种的有效手段。因此，区分不同普通菜豆材料的遗传背景和起源是选育优良亲本的一个重要环节。区分不同种质资源遗传背景的方法主要有两个，一是根据形态标记，如株高、叶形、籽粒大小、籽粒颜色等。形态标记具有易于观察，技术难度小的优点，但是该标记受外界环境如气温、日照长短、土壤、播种期等影响大，异变易，稳定性差，判断基因型错误率高，需要有丰富的实践经验才能有较准确的结果。二是DNA分子标记，是一种基于基因组差异的标记类型，其多态性类型与作物的遗传背景密切相关，具有相同遗传背景的材料具有相同的标记类型，因此应用分子标记可以很好的鉴定作物的遗传背景，是作物育种很好的辅助选择工具。常用的分子标记包括SSR、RFLP、AFLP、RAPD和SNP等标记类型。其中SSR、RFLP、AFLP和RAPD标记的多态性不如SNP标记。另外，RFLP、AFLP和RAPD标记在应用中需要大量的酶切实验和PCR反应，存在技术难度高、工作程序复杂，工作量大的问题。SSR标记在应用中需要很多个SSR标记同时使用才能判断一个材料的基因型，需要做大量的PCR反应，存在工作量大的问题。SNP标记虽然多态性高，但遗传稳定性差，且应用过程中需要进行大量的测序反应，成本高，一般的研究者很少使用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种鉴定普通菜豆种质起源的引物及方法，旨在解决在应用其他标记(SR、RFLP、AFLP、RAPD和SNP)对普通菜豆起源进行鉴定中存在的技术难度高、工作程序复杂、成本高和稳定性差的问题。本专利技术是这样实现的，一种鉴定普通菜豆种质起源的引物，所述鉴定普通菜豆种质起源的引物命名为Pv97包括：SEQIDNO：1和SEQIDNO：2；引物序列SEQIDNO：1：Pv-F：5'AGGTTGGGACTGCTGTGGTTAC3'；引物序列SEQIDNO：2Pv-R：5'TTTCACAGTTTCGCTGAGTTGC3'。本专利技术的另一目的在于提供一种鉴定普通菜豆种质起源的方法，所述鉴定普通菜豆种质起源的方法包括：模板基因组DNA提取与稀释；引物SEQIDNO：1和SEQIDNO：2的合成与稀释，纯化方式选用PAGE，将引物用无菌的双蒸水pH8.0溶解并稀释至5μM；PCR仪的选择与扩增；PCR扩增产物电泳；PCR扩增产物检测，将电泳后的凝胶放在凝胶成像仪的紫外灯下观察，PCR扩增产物会出现800bp或900bp的条带，扩增产物为800bp对应的种质属于安第斯基因库，扩增产物为900bp对应的种质属于中美洲基因库。进一步，所述模板基因组DNA提取与稀释具体包括：将无病虫害的欲被检测普通菜豆种子用无菌水浸没吸胀12小时；取吸胀的种子剥去种皮和子叶，取三片小的三出复叶于2mL离心管内，加入50μl提取缓冲液研磨至糊状，缓冲液包含100mMTris-HclpH＝8.0，1MKCl，10mMEDTA；95℃-100℃煮沸10分钟；冰上冷却2分钟；用100μl去离子水稀释后10000rpm离心3-5分钟；取上清液做模板。进一步，所述PCR反应体系：总体积20μl，包括10×PCRbuffer2.5μl，MgCl2(25mM)1.4μl，dNTPmix(10mMeach)0.4μl，Pv-F(5μM)1μl，Pv-R(5μM)1μl，DNAtemplate(40ng/mL)2μl，TaqDNAPolymerase(5U/μl)0.2μl，ddH2O11.5μl。进一步，所述PCR反应程序：94℃预变性3min后，94℃变性30s，55.5℃退火50s，72℃延伸1.5min，30个循环，最后72℃延伸10min。进一步，所述PCR扩增产物电泳具体方法如下：配置1×TBE缓冲液：54gTris，27.5g硼酸，4.6gEDTANa2溶于去离子水中，定容至5L；制备琼脂糖凝胶：用1×TBE缓冲液配0.8％琼脂糖凝胶，将熔化琼脂糖凝胶溶液倒入电泳支架上，放上梳子，梳子须离开电泳支架底部1mm，待凝胶凝聚后，拔去梳子，将支架放入装有1×TBE缓冲液的电泳槽中，缓冲液应淹没过胶；加样：取PCR扩增产物样品5μL，滴加1μL上样缓冲液(混匀，缓冲液含10mMTris-ClpH7.6，0.03％bromophenolblue，0.03％xylenecyanol，60％glycerol，60mMEDTA；用微量移液器加入样品槽中，并将3μL500bpDNALadder加入相邻的点样孔；电泳：凝胶点样端朝负极，通电，维持电压为10v/cm至溴酚蓝移到距边1cm处，取出凝胶。进一步，所述PCR扩增产物检测：用0.8本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定普通菜豆种质起源的引物，其特征在于，所述鉴定普通菜豆种质起源的引物命名为Pv97包括：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；引物序列SEQ ID NO：1：Pv‑F：5'AGGTTGGGACTGCTGTGGTTAC 3'；引物序列SEQ ID NO：2Pv‑R：5'TTTCACAGTTTCGCTGAGTTGC 3'。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定普通菜豆种质起源的引物，其特征在于，所述鉴定普通菜豆种
质起源的引物命名为Pv97包括：SEQIDNO：1和SEQIDNO：2；
引物序列SEQIDNO：1：Pv-F：5'AGGTTGGGACTGCTGTGGTTAC3'；
引物序列SEQIDNO：2Pv-R：5'TTTCACAGTTTCGCTGAGTTGC3'。
2.一种鉴定普通菜豆种质起源的方法，其特征在于，所述鉴定普通菜豆种
质起源的方法包括：
模板基因组DNA提取与稀释；
引物SEQIDNO：1和SEQIDNO：2的合成与稀释，纯化方式选用PAGE，
将引物用无菌的双蒸水pH8.0溶解并稀释至5μM；
PCR仪的选择与扩增；
PCR扩增产物电泳；
PCR扩增产物检测，将电泳后的凝胶放在凝胶成像仪的紫外灯下观察，PCR
扩增产物会出现800bp或900bp的条带，扩增产物为800bp对应的种质属于安
第斯基因库，扩增产物为900bp对应的种质属于中美洲基因库。
3.如权利要求2所述的鉴定普通菜豆种质起源的方法，其特征在于，所述
模板基因组DNA提取与稀释具体包括：
将无病虫害的欲被检测普通菜豆种子用无菌水浸没吸胀12小时；
取吸胀的种子剥去种皮和子叶，取三片小的三出复叶于2mL离心管内，加
入50μl提取缓冲液研磨至糊状，缓冲液包含100mMTris-HclpH＝8.0，1MKCl，
10mMEDTA；
95℃-100℃煮沸10分钟；
冰上冷却2分钟；
用100μl去离子水稀释后10000rpm离心3-5分钟；
取上清液做模板。
4.如权利要求2所述的鉴定普通菜豆种质起源的方法，其特征在于，所述
PCR反应体系：总体积20μl，包括10×PCRbuffer2.5μl，MgCl2(25mM)1.4μl，
dNTPmix(10mMeach)0...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈吉宝，王述民，武晶，王兰芬，增辉，王晨，曹苑南，段鹏飞，
申请(专利权)人：南阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南;41