12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒及其应用，包括有用于扩增如下12种脑炎病毒特异基因位点的引物：JeV，HTLV1，WNV，HSV1，HSVII，HHV6，JCV，HTLV2，BBF，HCMV，EBV及VZV。本发明专利技术具有以下优点：本发明专利技术所述的试剂盒能够多重检测、灵敏度高且使用快捷方便。此外，本发明专利技术采用特异性的引物序列，保证检测结果的可靠性；该检测方法操作简单，省时省力；检测通量大，试剂耗材成本低；可直接对脑炎病原体样本提取的核酸进行检测；对检测平台和人工技术水平要求低，能够在常规检测中广泛推广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因检测领域，涉及一种利用通用引物介导的多重PCR扩增方法检测12种脑炎病毒核酸的试剂盒及其应用。
技术介绍
病毒性脑炎是由多种病毒引起的中枢神经系统感染性疾病，因一年四季均可发生，故又称为散发性脑炎，其发病率约为(3.5～7.4)/10万，近年来呈逐年上升趋势，病毒性脑炎多发于儿童，该病往往缺乏特异性临床表现，病情严重者脑实质严重受损，可导致神经系统后遗症，甚至死亡。目前认为，在脑脊液(Cerebrospinalfluids，CSF)中检出病毒、病毒核酸或病毒特异性抗体则可明确中枢神经系统病毒感染的病因。用分子生物学检测方法在CSF标本中检出病毒核酸，被认为是中枢神经系统病毒感染性疾病病因诊断的标准。引起病毒性脑炎的病毒较多，目前已知国内外报道的就有高达100多种病毒可导致脑实质或脑膜炎症病变，并且不断发现新的病毒，脑炎发病率和发病人群有逐年增加的趋势。临床统计数据表明，约20％的病毒性脑炎是由DNA病毒感染所致，其余均由RNA病毒感染引起。引起病毒性脑炎的病毒主要有肠道病毒、疱疹病毒(HSV1、HSV2、HHV6、EB、VZV、HCMV)、流行性乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、JC病毒、人T细胞白血病病毒(HTLV1、HTLV2)和伯氏疏螺旋体。流行性乙型脑炎(Japaneseencephalitis)是由流行性乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)，又称日本脑炎病毒，是RNA病毒，引起的以中枢神经系统损害为特征的一种急性传染病，是一种自然疫源性人兽共患病，是病毒性脑炎中的重要一员，致死率高达5％～35％，严重威胁人类的健康和生命安全。西尼罗病毒(WNV)属于黄病毒科、黄病毒属的重要成员，是RNA病毒。人感染WNV后，通常表现为西尼罗热、西尼罗病毒性脑炎，极少数患者表现为严重的胰腺炎、肝炎、心肌炎等。大约有1/300～1/150的西尼罗病毒感染者发展为脑炎、脑膜脑炎，一般称为西尼罗病毒性脑炎，临床症状表现为发热、头痛、抽搐、意识障碍、脑膜刺激等。西尼罗病毒性脑炎病死率大约为3～15％，多为老年人或免疫力低下病人。人T细胞白血病病毒(HTLV))是1980年美国人Gallo首先从皮肤型T细胞淋巴瘤患者体内发现的第一种人类逆转录病毒，按基因组学及血清学反应可分为1型(HTLV-I)和2型(HTLV-II)。该病毒为球型颗粒，内部由RNA核蛋白及围绕在外的20面体蛋白衣壳组成，最外层具有包膜结构，表面镶嵌有糖蛋白。目前全世界大约有1000到2000万人感染HTLV病毒，而在我国的北京、广西、江西、新疆、柳州、合肥和四川等10多个省市已发现了HTLV感染病例，同时某些沿海地区也出现了局部小规模流行。HTLV感染细胞主要通过细胞间感染的方式，游离病毒颗粒是没有感染能力的。HTLV感染细胞与未感染细胞建立突触，进而使病毒蛋白和RNA染色体组进入靶细胞。通过逆转录酶使病毒RNA逆转录为cDNA，同时这种前病毒DNA被整合到宿主细胞，最终引起成人T细胞白血病、热带痉挛性瘫痪及其他相关神经系统疾病。伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)属于原核生物界螺旋体目、螺旋体科疏螺旋体属的一种，是一种单细胞疏松盘绕的左旋螺旋体。是由蜱虫传播的一种自然疫源性、人畜共患疾病，通过肩突硬蜱感染人体宿主，可引起多系统器官损害，游走性红斑、神经炎、关节炎、心肌炎等。伯氏疏螺旋体在细菌中是最复杂的一个，基因组包含950kb线性染色体，由不同的线性质粒和环形质粒组成。对于伯氏疏螺旋体的分子生物学检测主要是PCR方法，在大多数的研究中针对不同的基因序列设计引物，如ospA、ospC、16SrRNA等。单纯性疱疹(HerpesSimplex)是一种由疱疹病毒所致的病毒性皮肤病。单纯疱疹病毒包括单纯疱疹病毒I型(HSVI)和单纯疱疹病毒II型(HSVII)，其中HSVI首要引起生殖器以外的皮肤、粘膜(口腔粘膜)和器官(脑)的感染；HSVII首要引起生殖器部位皮肤粘膜感染，通常认为与宫颈癌发生有关。水痘－带状疱疹病毒(varicella-zostervirus，VZV)，在儿童初次感染引起水痘，恢复后病毒潜伏在体内，少数病人在成人后病毒再发而引起带状疱疹。多见于成年人和老年人。成人水痘症状较严重，常并发肺炎，死亡率较高。有免疫缺陷的儿童和无免疫力的新生儿感染水痘，病情凶险，可能是一种致死性感染。如孕妇患水痘除病情严重，可导致胎儿畸形、流产或死亡。人巨细胞病毒(humancytomegalovirus)又称为涎病毒，是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒。这种病毒进入细胞内以后会导致细胞增大，所以叫做巨细胞病毒。EB病毒(Epstein-Barr)是一种DNA病毒，呈球形，直径为180nm～200nm，在B淋巴细胞中复制，为95％以上的成人所携带。它是传染性单核细胞增多症的病原体，还与鼻咽癌、儿童淋巴瘤的发生有密切关系，被列为可能致癌的人类肿瘤病毒之一。人疱疹病毒6型(HHV-6)原发感染后多无症状，少数可引起幼儿丘疹或婴儿玫瑰疹。常急性发病，先有高热(39℃数天)和上呼吸道感染症状，退热后颈部和躯干出现淡红色斑丘疹。此外，感染可导致中枢神经系统症状，包括癫痫、脑膜炎和大脑炎等。JC病毒为小双链DNA病毒，在人群中广泛感染，只有一种血清型，可分为30多个基因型，JC病毒可垂直传播，也可通过呼吸道、消化道传播，严重免疫抑制患者感染JC病毒后可引起进行性多灶脑白质病。在脑脊液(Cerebrospinalfluids，CSF)中检出病毒、病毒核酸或病毒特异性抗体则可明确中枢神经系统病毒感染的病因。病毒分离阳性为中枢神经系统病毒感染性疾病病原学诊断的标准，但费时、费力，且CSF中病毒含量低，分离的阳性率不高。急性期在CSF中检测到病毒的特异性IgM抗体，可作为早期诊断的依据，但CSF中IgM含量低，且不同病毒及其血清型需要选择相应的试剂盒，否则易漏诊。PCR的出现，极大的增加了检测手段的敏感性，用分子生物学检测方法在CSF标本中检出病毒核酸，被认为是中枢神经系统病毒感染性疾病病因诊断的金标准。但目前缺乏利用PCR方法检测CSF标本中病毒核酸的试剂盒，尤其缺乏利用多重PCR方法在一个反应管中同时检测CSF标本中多种病毒核酸的试剂盒。多重PCR(MultiplexPCR，M-PCR)是指在同一个反应体系中，加入多对特异性引物，如果存在与各引物对特异性互补的模板，即可同时在一个反应管中扩增出一条以上的目的DNA片段本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒，其特征在于，包括有用于扩增如下12种脑炎病毒特异基因位点的引物：JeV，HTLV1，WNV，HSV1，HSVII，HHV6，JCV，HTLV2，BBF，HCMV，EBV及VZV。

【技术特征摘要】
1.一种12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒，其特征在于，包括有用于扩增如下12种
脑炎病毒特异基因位点的引物：JeV，HTLV1，WNV，HSV1，HSVII，HHV6，JCV，
HTLV2，BBF，HCMV，EBV及VZV。
2.根据权利要求1所述一种12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述引
物是在特异性引物的5’端添加一段通用引物序列组合而成的嵌合引物。
3.根据权利要求1所述的一种12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述
引物中，特异性引物序列为：JeV，SEQIDNO.1～2；HTLV1，SEQIDNO.3～4；WNV，
SEQIDNO.5～6；HSV1，SEQIDNO.7～8；HSVII，SEQIDNO.9～10；HHV6，SEQID
NO.11～12；JCV，SEQIDNO.13～14；HTLV2，SEQIDNO.15～16；BBF，SEQIDNO.17～18；
HCMV，SEQIDNO.19～20；EBV，SEQIDNO.21～22；及VZV，SEQIDNO.23～24；通
用引物序列为：SEQIDNO.25～26。
4.根据权利要求1所述的一种12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述
通用引物在扩增体系中的终浓度为400nM～1μM；所述嵌合引物在扩增体系中的终浓度
为20nM～100nM。
5.根据权利要求4所述的一种12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述
通用引物在扩增体系中的终浓度为800nM；所述嵌合引物在扩增体系中的终浓度为
60nM。
6.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文干，金鑫，朱坤，管海华，
申请(专利权)人：南京美宁康诚生物科技有限公司，北京美康基因科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32