通过顺序杂交编条形码的分子多重标记制造技术

本发明专利技术，除其他以外，提供了用于检测和/或定量细胞、组织、器官或生物体中的核酸的技术。在一些实施方案中，本发明专利技术通过顺序编条形码提供了用于大量靶的高通量谱分析的方法，所述靶诸如转录物和/或DNA基因座。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过顺序杂交编条形码的分子多重标记对相关申请的交叉引用本申请要求2013年4月30日提交的美国临时申请序列号61/817,651和2014年3月28日提交的美国临时申请序列号61/971,974的优先权，通过引用各自以其整体并入本文。关于联邦政府赞助的研究或开发的声明依据由美国国家卫生研究院授予的拨款号R01HD075605，美国政府对此专利技术具有一定的权利。
本申请涉及但不限于通过顺序杂交编条形码的分子多重标记。专利技术背景细胞的转录谱分析(profiling)是许多目的必需的。能够在单细胞中分辨多种mRNA的显微成像可以提供关于转录物丰度和定位的有价值的信息，对理解细胞鉴定的分子基础和开发疾病治疗是重要的。因此，对通过例如显微成像对细胞中转录物的谱分析新的和改进的方法存在需要。专利技术概述本专利技术提供与对细胞中的，尤其是单细胞中的转录物或DNA基因座谱分析的现有技术相关的挑战或缺点的某些洞见。此外，本专利技术提供用于有效地实现此类谱分析包括单细胞的此类谱分析的新技术。提供的技术是广泛有用的，包括例如用于分离的细胞、组织中的细胞、器官中的细胞和/或生物体中的细胞的谱分析。例如，本专利技术提供以下洞见：现有技术诸如单细胞RNA-seq或qPCR，需要将单细胞分离并且将其放入多孔格式中，这会是成本高昂的、劳动密集的并且倾向产生伪结果(pronetoartifacts)的多重步骤的方法。此外，本专利技术认识到，首先利用酶促反应将mRNA转换成DNA模板的现有原位测序技术可以是非常低效的(例如在mRNA向DNA转化过程中)，因此，通常，只有一小部分的RNA被转化和检测。本专利技术提供了这样的具体洞见：关于这种低效率(对于RT估计在1％和对于PLA在10％)的一种主要缺点是它可以在基因表达测量中引入显著的噪音和(ad)偏倚。本专利技术还认识到，利用单分子荧光原位杂交(smFISH)的现有光谱mRNA编条形码技术需要不同的荧光基团用于规模放大，并且可能在可生成的条形码的数量上被限制。smFISH还需要在杂交期间将探针分裂成编条形码的亚组。因为smFISH通常使用两种或更多种颜色用于靶，其在图像中产生高密度的对象，这可增加数据分析的复杂性。除其他方面，本专利技术提供了用于对例如转录物和/或DNA基因座谱分析的新技术，该新技术克服了与本专利技术之前的方法有关的问题的一种或更多种或所有。在一些实施方案中，本专利技术提供用于通过允许不同靶的多路复用的顺序条形码方案在细胞中检测多个靶(例如转录物或DNA基因座)的方法。在一些实施方案中，本专利技术提供了方法，所述方法包括以下步骤：(a)进行第一接触步骤，所述第一接触步骤包括使包含多种(apluralityof)核酸的细胞与第一多种可检测地标记的寡核苷酸接触，所述第一多种可检测地标记的寡核苷酸的每一种靶向核酸并且被可检测部分标记，因此组合物至少包含：(i)第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸靶向第一核酸并且被第一可检测部分标记；和(ii)第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸靶向第二核酸并且被第二可检测部分标记；(b)在第一接触步骤之后对细胞成像，以便检测所述第一多种的寡核苷酸与其靶的相互作用；(c)进行第二接触步骤，所述第二接触步骤包括使所述细胞与第二多种可检测地标记的寡核苷酸接触，所述第二多种包括靶向被所述第一多种靶向的重叠核酸的寡核苷酸，因此所述第二多种至少包含：(i)第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸任选地在序列上与所述第一寡核苷酸相同，所述第三寡核苷酸靶向所述第一核酸；和(ii)第四寡核苷酸，所述第四寡核苷酸任选地在序列上与第二寡核苷酸相同，所述第四寡核苷酸靶向所述第二核酸，其中所述第二多种与所述第一多种的不同在于，存在于所述第二多种中的寡核苷酸的至少一种被与所述第一多种中靶向相同核酸的对应的寡核苷酸不同的可检测部分标记，因此在所述第二多种中：(iii)所述第三寡核苷酸被所述第一可检测部分、所述第二可检测部分或第三可检测部分标记；并且(iv)第四寡核苷酸被所述第一可检测部分、所述第二可检测部分、所述第三可检测部分或第四可检测部分标记，其中所述第三寡核苷酸被与所述第一寡核苷酸所用的不同的可检测部分标记，或所述第四寡核苷酸被与所述第二寡核苷酸所用的不同的可检测部分标记，或两者；(d)在所述第二接触步骤之后对细胞成像，以便检测所述第二多种的寡核苷酸与它们的靶的相互作用；以及(e)任选地所述重复接触和成像步骤，每次用新的多种可检测地标记的寡核苷酸，所述新的多种可检测地标记的寡核苷酸包含靶向被所述第一多种和第二多种靶向的重叠核酸的寡核苷酸，其中由于标记靶向相同核酸的寡核苷酸的可检测部分中的至少一种差异，所利用的每个多种(eachutilizedplurality)与所利用的每个其他的多种(eachotherutilizedplurality)不同。在一些实施方案中，本专利技术(例如，如在图1中呈现的)，提供了方法，所述方法包括以下步骤：(a)进行第一接触步骤，所述第一接触步骤包括使包含多种转录物和DNA基因座的细胞与第一多种可检测地标记的寡核苷酸接触，所述第一多种可检测地标记的寡核苷酸的每一种靶向转录物或DNA基因座并且被可检测部分标记，因此组合物至少包含：(i)第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸靶向第一转录物或DNA基因座并且被第一可检测部分标记；和(ii)第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸靶向第二转录物或DNA基因座并且被第二可检测部分标记；(b)在第一接触步骤之后对细胞成像，以便检测所述第一多种的寡核苷酸与它们的靶的识别；(c)进行第二接触步骤，所述第二接触步骤包括使所述细胞与第二多种可检测地标记的寡核苷酸接触，所述第二多种包括靶向被第一多种靶向的重叠转录物和/或DNA基因座的寡核苷酸，因此所述第二多种至少包含：(i)第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸任选地在序列上与第一寡核苷酸相同，所述第三寡核苷酸靶向所述第一转录物或DNA基因座；和(ii)第四寡核苷酸，所述第四寡核苷酸任选地在序列上与第二寡核苷酸相同，所述第四寡核苷酸靶向所述第二转录物或DNA基因座，其中所述第二多种与第一多种的不同在于，存在于第二多种中的寡核苷酸的至少一种被与所述第一多种中靶向相同的转录物或DNA基因座的对应的寡核苷酸不同的可检测部分标记，因此在所述第二多种中：(iii)所述第三寡核苷酸被所述第一可检测部分、所述第二可检测部分或第三可检测部分标记；并且(iv)所述第四寡核苷酸被所述第一可检测部分、所述第二可检测部分、所述第三可检测部分或第四可检测部分标记，其中所述第三寡核苷酸被与所述第一寡核苷酸所用的不同的可检测部分标记，或第四寡核苷酸被与第二寡核苷酸所用的不同的可检测部分标记，或两者；(d)在所述第二接触步骤之后对细胞成像，以便检测检测所述第二多种的寡核苷酸与它们的靶的识别；以及(e)任选地重复所述接触和成像步骤，每一次用新的多种可检测地标记的寡核苷酸，所述新的多种可检测地标记的寡核苷酸包含靶向被所述第一多种和第二多种靶向的重叠转录物或DNA基因座的寡核苷酸，其中由于标记靶向相同转录物或DNA基因座的寡核苷酸的可检测部分中的至少一种差异，所利用的每个多种与所利用的每个其他的多种不同。在一些实施方案中，被可检测地标记的寡核苷酸靶向的核酸是转录物和/或DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，所述组合物包含多种可检测地标记的寡核苷酸，所述多种可检测地标记的寡核苷酸的每种靶向转录物或DNA基因座并且被可检测部分标记，因此所述组合物至少包含：(i)第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸靶向第一转录物或DNA基因座并被第一可检测部分标记；和(ii)第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸靶向第二转录物或DNA基因座并被第二可检测部分标记。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.04.30 US 61/817,651;2014.03.28 US 61/971,9741.一种非诊断目的的方法，所述方法包括以下步骤：(a)进行第一接触步骤，所述第一接触步骤包括使包含多种核酸的样品与第一多种可检测地标记的寡核苷酸接触，所述第一多种可检测地标记的寡核苷酸的每种靶向所述样品中的核酸并被可检测部分标记，因此所述第一多种可检测地标记的寡核苷酸至少包含:(i)第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸靶向第一核酸并被第一可检测部分标记；和(ii)第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸靶向第二核酸并被第二可检测部分标记；(b)在所述第一接触步骤之后对所述样品成像，以便检测所述第一多种可检测地标记的寡核苷酸的寡核苷酸与其靶序列的相互作用；(c)进行第二接触步骤，所述第二接触步骤包括使所述样品与第二多种可检测地标记的寡核苷酸接触，其中所述第二多种可检测地标记的寡核苷酸包括靶向被所述第一多种可检测地标记的寡核苷酸靶向的重叠核酸的寡核苷酸，因此所述第二多种可检测地标记的寡核苷酸至少包含：(i)第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸在序列上与所述第一寡核苷酸相同，所述第三寡核苷酸靶向所述第一核酸；和(ii)第四寡核苷酸，所述第四寡核苷酸在序列上与所述第二寡核苷酸相同，所述第四寡核苷酸靶向所述第二核酸，其中所述第二多种可检测地标记的寡核苷酸与所述第一多种可检测地标记的寡核苷酸的不同在于，存在于所述第二多种可检测地标记的寡核苷酸中的寡核苷酸的至少一种被与所述第一多种可检测地标记的寡核苷酸中的靶向相同的核酸的对应寡核苷酸不同的可检测部分标记，因此在所述第二多种可检测地标记的寡核苷酸中：(iii)所述第三寡核苷酸被所述第一可检测部分、所述第二可检测部分或第三可检测部分标记；并且(iv)所述第四寡核苷酸被所述第一可检测部分、所述第二可检测部分、所述第三可检测部分或第四可检测部分标记，其中所述第三寡核苷酸被与所述第一寡核苷酸所用的不同的可检测部分标记，或所述第四寡核苷酸被与所述第二寡核苷酸所用的不同的可检测部分标记，或两者；(d)在所述第二接触步骤之后对所述样品成像，因此以便检测所述第二多种可检测地标记的寡核苷酸的寡核苷酸与其核酸靶的相互作用；以及(e)重复所述第一接触步骤、所述第二接触步骤和成像步骤，每次用新的多种可检测地标记的寡核苷酸，所述新的多种可检测地标记的寡核苷酸包含靶向被所述第一多种可检测地标记的寡核苷酸和所述第二多种可检测地标记的寡核苷酸靶向的重叠核酸的寡核苷酸，其中由于标记靶向相同核酸的寡核苷酸的可检测部分中的至少一种差异，所利用的多种可检测地标记的寡核苷酸的每个多种与所利用的多种可检测地标记的寡核苷酸的每个其他的多种不同，其中步骤(a)至(e)针对所述样品中的每个独特的核酸产生独特的分子条形码。2.权利要求1所述的方法，其中所述核酸靶是转录产物或DNA基因座。3.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包括细胞、核酸提取物、蛋白提取物或组织。4.如权利要求1所述的方法，所述方法包括N个接触步骤，其中N至少是2，并且多种可检测地标记的寡核苷酸的每个多种包含F个可检测的部分，其中F至少是2。5.如权利要求4所述的方法，其中N大于2并且其中两个接触步骤是相同的。6.如权利要求4所述的方法，其中多种可检测地标记的核苷酸的每个多种靶向(F)N个核酸靶。7.如权利要求4所述的方法，其中多种可检测地标记的寡核苷酸的每个多种靶向少于(F)N个核酸靶。8.如权利要求1所述的方法，其中多种可检测地标记的寡核苷酸的每个多种靶向相同的核酸靶。9.如权利要求1所述的方法，所述方法在每个成像步骤之后包括去除多种可检测地标记的寡核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙·蔡，埃里克·吕贝克，铁木尔·契彦塔耶夫，阿梅特·科斯坤，庭芳·何，长·赫·孙，希尔·沙哈，
申请(专利权)人：加州理工学院，
类型：发明
国别省市：美国;US