五重荧光PCR快速超敏检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法，用于检测样品中淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人型支原体和生殖支原体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于核酸检测
，具体而言，本专利技术涉及能同时对沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲支原体、人型支原体和生殖支原体等五种致病病原体进行检测的多重实时PCR方法，其快速、超敏且一步完成。另外，本专利技术还涉及上述PCR方法中所涉及的试剂，如互不相干绕的引物、探针等，以及用于上述方法的检测试剂盒和相应检测试剂盒的制备应用等。
技术介绍
淋病奈瑟菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)、人型支原体(MH)、生殖支原体(MG)是引起泌尿生殖系统感染的5种主要病原体，可引起尿道炎、前列腺炎、宫颈炎、输卵管炎甚至不孕不育等。其中，淋病奈瑟菌(Niesseria gonorrhoeae, NG)是引起淋病的病原体，而淋病一直是性传播疾病中最常见的疾病，可引起严重的泌尿生殖道疾病，尤其是女性患者常导致盆腔炎症性疾病和继发不孕；沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, CT)也是重要的性传播疾病的病原体之一，可以导致阴道、尿道和上行的生殖道感染，也能导致盆腔炎、输卵管损伤；解脲支原体(Ureaplasma urealyticum, UU)是引起泌尿生殖道炎症(NGU)及男女不育不孕的主要病原体，也是性传播的常见病原体，是常见的泌尿生殖寄生物；人型支原体(Mycoplasma hominis, MH)是成人泌尿生殖道的一种常见的微生物，和某些妇科、男性疾病有关，也和新生儿呼吸道感染、中枢神经系统感染有关；生殖支原体(Mycoplasma genitalium, MG)可引起非淋菌性尿道炎(NGU)、前列腺炎、宫颈炎、子宫内膜炎、附件炎及不孕，同时可能在HIV感染中起着重要的作用，被称为“AIDS相关支原体”。美国自1995年开展生殖道衣原体感染病例报告工作以来，其发病率很高，在180/万以上；非洲性病发病率更高，如津巴布韦卫生系统较为完善，全国1000多万人口，I年报告的性病病例就达80万，占总人口近10%。而随着我国改革开放的不断深入，社会经济不断发展，人口流动不断加强，性病的感染的有逐年上升的趋势，目前我国淋病和梅毒发病率高于发达国家，低于非洲国家，而且我国性病的发病率仍保持快速增长，1991 - 2000年全国性病平增长19. 30%，尤其是梅毒、生殖器疱疹和N⑶增长幅度在40%以上，而且性病和艾滋病的流行密切相关，性病的流行将促进艾滋病的传播。现在对淋病奈瑟菌、解脲支原体、人型支原体、生殖支原体的检测主要以培养法为主；沙眼衣原体主要针对其抗原进行免疫学检测。培养法检测耗时长，一般需经48-72小时才能得到结果；灵敏度低，受采集、运送、保存等影响较大，容易出现假阴性结果；操作烦琐，导致各种操作的结果判别标准难以统一，需要的技术和设备要求高。免疫学方法相比培养法有了长足的进步，但是因为生殖道微生物之间存在的交叉反应使得该方法的特异性受到影响，容易出现假阳性反应，给治疗带来误判的可能。近年也有报道利用聚合酶链反应(PCR)来实施对病原体的检测。PCR是当今核酸检测中最常用的技术之一，其中实时(Real Time)PCR技术采用了诸如荧光标记等可实时检测的标记，在核酸检测、临床诊断及分子生物学研究等方面，可以快速地获得结果。常规的实时 PCR 检测，如中国专利 CN1768151A、CN101189505A、CN101273262A、CN101302473A 等，仅用于检测单一靶核酸；中国专利CN101624629A公开了(在单个PCR反应容器中)多重检测样品中靶核酸的实时PCR方法，执行速度更快、更整合，但是其仅仅用于检测HBV、HCV和HIV等三种靶核酸，没有更多重检测的实践，例如没有关于如何设计互不干扰的引物对和探针的提示，更没有提示对探针浓度的进行调整。然而，对于更多重的实时PCR检测，尤其是对于淋病奈瑟菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)、人型支原体(MH)、生殖支原体(MG)这五种病原体(其中三种支原体的同源性较高)来说，通过目前已知的引物对和探针序列设计方法(包括现有的生物信息学软件)，无法设计出这五重互不干扰的引物对和探针，设计出的将导致互相干扰而使得荧光检测曲线失真。为此，本专利技术人经过艰苦的努力并且凭借了一些运气，针对这五种病原体，设计出了互相干扰程度在实时PCR检测中可接受的引物对和探针，更令人意外的是，在探针浓度上进行了调整，增强了它们的检测曲线都能的清晰度和分辨度(曲线相互分离)，使得检测灵敏度达到了超敏级，而且可以不使用内对照。另外，本专利技术对于上述微生物的核酸提取方法进行了优化。
技术实现思路
本专利技术的要解决的问题在于提供新的五重实时PCR方法，用于五重检测样品中淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人型支原体和生殖支原体，通过互相干扰程度在实时PCR检测中可接受的引物对和探针，并任选优化探针浓度和核酸提取的过程，可以同时高特异性、高灵敏度和高重复性地分辨出样品中是否存在来自上述微生物的靶核酸。另外，本专利技术还涉及提供上述方法的检测试剂盒和应用等。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法，所述靶核酸来自淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人型支原体和生殖支原体，其包括，(I)在所述单个PCR反应容器中混合核酸提取液、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和靶核酸探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中，靶核酸引物对包括 NG-F:ACCGTAACGTCTCTAAGTC,NG-R:GCAAGATTTCCGATTTGGC,CT-F:TGTCCATATCTTTGATACGAT,CT-R:CTCTGATATTTGAAGACTCTACA,UU-F:CTGCTCGTGAAGTATTACA,UU-R:GTACCATCTGGGAAAGTAC,MH-F:TGTGGTTTAATTTGAAGATACAT，MH-R:AGTCCTCAACTTAATGTTAGA,MG-F:AGGCAGTAATGTCAATCACA,和MG-R:GGCTTTATCATTGGCAAACG，靶核酸探针包括NG-P:CAGACATCACGCACCGAAGCAT，CT-P:CCAAGCCGAGTCTACAGTTATAGGTCA，UU-P:ACCAACCATTGTATCTACACCTTCCATA，MH-P:CCACTCTTGACATCCTTCGCATA，和MG-P:CCATTCGCATCCAACTTCACCTCT ；(2)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；和，(3)根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有靶核酸存在于样品中。可以对核酸提取液进行直接检测，但是优选对样品进行处理后获得核酸提取液后再进行检测。所以，优选核酸提取液是提取样品中的核酸而获得的提取液，如是采用磁珠提取法提取的。非特异性的磁珠提取法采用表面涂有非特异性核酸吸附类物质的顺磁性颗粒，在低PH(如，pH值5 7)和高盐浓度的情况下核酸可以吸附到顺磁性颗粒表面，在进行磁 分离和充分洗涤后，在高pH(如，pH值8、)、低盐浓度的条件下可将核酸洗脱下来，由此富集了核酸(如靶核酸)的样品可用于PCR试验；另外还可以采用特异性吸附(如本文档来自技高网...

【技术保护点】
在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法，所述靶核酸来自淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人型支原体和生殖支原体，其包括，（1）在所述单个PCR反应容器中混合核酸提取液、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和靶核酸探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中，靶核酸引物对包括ACCGTAACGTCTCTAAGTC，GCAAGATTTCCGATTTGGC，TGTCCATATCTTTGATACGAT，CTCTGATATTTGAAGACTCTACA，CTGCTCGTGAAGTATTACA，GTACCATCTGGGAAAGTAC，TGTGGTTTAATTTGAAGATACAT，AGTCCTCAACTTAATGTTAGA，AGGCAGTAATGTCAATCACA，和GGCTTTATCATTGGCAAACG，靶核酸探针包括：CAGACATCACGCACCGAAGCAT，CCAAGCCGAGTCTACAGTTATAGGTCA，ACCAACCATTGTATCTACACCTTCCATA，CCACTCTTGACATCCTTCGCATA，和CCATTCGCATCCAACTTCACCTCT；（2）进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；和，（3）根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有靶核酸存在于样品中。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈悦科，张文艳，刘明霞，叶成果，王奕江，沈靖，
申请(专利权)人：苏州华益美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：