人类免疫缺陷病毒快速检测测试卡及其应用制造技术

本发明专利技术提供了HIV人抗体和HIV抗原快速检测测试卡，其包括底板、样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫以及荧光微球垫，其中，荧光微球垫吸附I型HIV抗原标记的荧光微球、II型HIV抗原标记的荧光微球、p24抗体标记的荧光微球和质控蛋白标记的荧光微球，硝酸纤维素膜上依次吸附I型HIV抗原、II型HIV抗原、p24抗体和抗所述质控蛋白的抗体。另外，本发明专利技术还提供了该测试卡的制备方法和快速检测HIV人抗体和抗原的应用等。

【技术实现步骤摘要】
人类免疫缺陷病毒快速检测测试卡及其应用
本专利技术属于免疫检测
，具体涉及快速检测人类免疫缺陷病毒(包括I型和II型)抗体和人类免疫缺陷病毒p24抗原的测试卡及其应用等。
技术介绍
艾滋病，获得性免疫缺陷综合征，是一种由人类免疫缺乏病毒(简称HIV)的反转录病毒感染后，因免疫系统受到破坏，逐渐成为许多伺机性疾病的攻击目标，促成多种临床症状，统称为综合征，而非单纯的一种疾病，而这种综合征可通过直接接触黏膜组织(mucosa)的口腔、生殖器、肛门等或带有病毒的血液、精液、阴道分泌液、乳汁而传染。由于艾滋病的高传染性，高传播范围及高死亡率，从发现艾滋病起，实际上就建立了相应的实验室诊断方法；由于检测的目的不同，也各自建立起不同的检测方法。检测方法大致分为两类：1.病原学检测1)病原分离：严格要求在P3实验室内进行，通过对患者血清高度浓缩，在电子显微镜下观察，分离HIV病毒。2)原位杂交：用同位素标记克隆的HIV病毒cDNA片段，与患者的组织细胞进行核酸杂交，经过放射自显影，来判定感染病毒的细胞。3)PCR：扩增HIVcDNA片段，通过荧光标记的特异性核酸探针，来检查是否受到HIV感染。4)逆转录酶的测定：通过测定患者血清中的逆转录酶的活性，来诊断是否受到HIV感染。5)淋巴细胞功能测定：通过测定淋巴细胞的功能，主要是对T4辅助淋巴细胞，来诊断是否感染HIV。6)p24抗原的检测:通过免疫反应,对血液中的p24抗原进行检测,作为HIV感染的早期诊断。2.HIV抗体检测HIV抗体检测的方法很多，如酶联免疫吸附实验(Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)、明胶颗粒凝集实验(Gelatineparticleagglutinationassay,PA)、乳胶凝集实验(Latexagglutinationassay,LA)、各种快速检测实验(Rapidtests)等。这些实验使用的抗原早期是完整病毒的裂解产物，这种抗原常常由于含有宿主细胞的成分而出现假阳性反应，同时这种抗原制备和纯化都比较困难，危险性大。此后的试剂使用重组或合成多肽HIV抗原，选择与免疫反应相关的抗原决定簇，敏感性和特异性均有所提高，这类抗原制备更为安全、容易、重复性好，但是重组抗原有时由于含有载体的组分而出现假阳性结果，尤其是HIV病毒本身容易突变，而多肽抗原由于缺乏合适的立体构象也会使敏感性下降从而导致假阴性，这将对推广应用来说堪称是灾难性的。例如，中国专利申请CN105842462A公开了一种检测HIV抗体的免疫层析测试条，应用荧光免疫层析技术和双抗原夹心法检测人血清中的HIV-I和HIV-2抗体；中国专利申请CN1858594A公开了人类免疫缺陷病毒抗体多指标快速检测方法，其利用包括p24、gp41和gp36等抗原蛋白片断的固定来进行检测；中国专利申请CN102445538A公开了艾滋病(HIV-1/2)尿液快速检测试剂，其基于胶体金技术检测HIV重组抗原p41、p42和p36。然而，上述现有技术都不涉及对相应抗原或抗原片断的选择，因此在检测容易突变的HIV病毒的时候，难以避免假阴性结果，为此，本专利技术人精心研究，研发了一种新的HIV人抗体和HIV抗原快速检测测试卡，不但能同时快速、高灵敏度、低变异系数地检测I型和II型HIV的人抗体和HIV的p24抗原，而且准确率高，能避免假阴性结果的出现，特别适合用于HIV的初筛。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种HIV人抗体和HIV抗原快速检测测试卡，其能进行快速、高灵敏度、低变异系数地检测，便于野外现场检测和床边检测等初筛，同时具有高度的准确性，尤其是避免假阴性结果，适合推广使用。另外，本专利技术还提供了该测试卡的制备方法和应用等。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了HIV人抗体和HIV抗原快速检测测试卡，其包括底板(1)和依次贴合在底板上的样品垫(2)、硝酸纤维素膜(8)和吸水垫(9)，硝酸纤维素膜(8)与吸水垫(9)连接，其中，样品垫(2)与硝酸纤维素膜(7)之间连接有贴合在底板上的荧光微球垫(3)，其中，荧光微球垫(3)吸附I型HIV抗原标记的荧光微球、II型HIV抗原标记的荧光微球、p24抗体标记的荧光微球和质控蛋白标记的荧光微球，硝酸纤维素膜(8)上在样品垫(2)至吸水垫(9)的方向上有依次吸附I型HIV抗原、II型HIV抗原、p24抗体和抗所述质控蛋白的抗体的三条分离的垂直于样品垫(2)至吸水垫(9)的方向的线。优选在本专利技术第一方面的测试卡中，所述I型HIV抗原的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。该抗原是本专利技术人从大量HIV的蛋白上研发出来的，对本专利技术第一方面的测试卡的高准确性起了关键作用。也优选在本专利技术第一方面的测试卡中，所述II型HIV抗原的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。该抗原是本专利技术人从大量HIV的蛋白上研发出来的，对本专利技术第一方面的测试卡的高准确性起了关键作用。荧光微球已经大量商品化，然而本专利技术人发现，它们用于本专利技术中的效果参差不齐，经研究发现，波长480nm处有吸收峰的带有羧基基团荧光微球(如购自OceanNanotech的)特别适合用于本专利技术中。所以，优选在本专利技术第一方面的测试卡中，所述荧光微球是在波长480nm处有吸收峰的带有羧基基团荧光微球。优选在本专利技术第一方面的测试卡中，所述标记的荧光微球通过如下方法制备：将所述荧光微球与EDC振荡混合后，用PBS缓冲液洗涤，再加入所述抗原、抗体或质控蛋白，振荡混合，然后加入含甘氨酸和ΒSA的PBS缓冲液振荡封闭，最后用含ΒSA和Proclin300的PBS缓冲液洗涤并稀释。通过上述方法可以分别制备所述I型HIV抗原标记的荧光微球、所述II型HIV抗原标记的荧光微球、所述p24抗体标记的荧光微球和所述质控蛋白标记的荧光微球。本专利技术人研究发现HIV上p24抗原的突变通常不在其表位上，因此采用现有的p24抗原制备其抗体即可有效识别。优选在本专利技术第一方面的测试卡中，所述p24抗体的抗原的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。本专利技术人发现，质控蛋白对本专利技术的效果也有一定影响，为了避免人样本中的物质对质控线的影响，优选采用半抗原及其抗体。优选在本专利技术第一方面的测试卡中，质控蛋白是DNP-BSA(二硝基氟苯-牛血清白蛋白)，即缀合了DNP(半抗原)的BSA；相应抗体优选是抗所述半抗原的抗体，即抗DNP抗体。采用DNP作为质控蛋白的半抗原，可有效地避免人样本对质控线的影响。在第二方面，本专利技术提供了制备本专利技术第一方面的测试卡的方法，其包括：(a)制备所述I型HIV抗原标记的荧光微球、所述II型HIV抗原标记的荧光微球、所述p24抗体标记的荧光微球和所述质控蛋白标记的荧光微球，然后混合吸附于荧光微球垫(3)上；(b)将所述I型HIV抗原、所述II型HIV抗原、所述p24抗体和所述抗所述质控蛋白的抗体分别划线于硝酸纤维素膜(8)上；和，(c)将步骤(a)获得的荧光微球垫(3)和步骤(b)获得的硝酸纤维素膜(8)同底板(1)、样品垫(2)和吸水垫(9)组装成所述测试卡。其中，制备所述HIV抗原标记的荧光微球和所述质控蛋白标记的荧光微球的方法可以是如下方法：将所述荧光微球与EDC振荡混合后，用PBS缓冲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.HIV人抗体和HIV抗原快速检测测试卡，其包括底板(1)和依次贴合在底板上的样品垫(2)、硝酸纤维素膜(8)和吸水垫(9)，硝酸纤维素膜(8)与吸水垫(9)连接，其特征在于，样品垫(2)与硝酸纤维素膜(7)之间连接有贴合在底板上的荧光微球垫(3)，其中，荧光微球垫(3)吸附I型HIV抗原标记的荧光微球、II型HIV抗原标记的荧光微球、p24抗体标记的荧光微球和质控蛋白标记的荧光微球，硝酸纤维素膜(8)上在样品垫(2)至吸水垫(9)的方向上有依次吸附I型HIV抗原、II型HIV抗原、p24抗体和抗所述质控蛋白的抗体的三条分离的垂直于样品垫(2)至吸水垫(9)的方向的线。

【技术特征摘要】
1.HIV人抗体和HIV抗原快速检测测试卡，其包括底板(1)和依次贴合在底板上的样品垫(2)、硝酸纤维素膜(8)和吸水垫(9)，硝酸纤维素膜(8)与吸水垫(9)连接，其特征在于，样品垫(2)与硝酸纤维素膜(7)之间连接有贴合在底板上的荧光微球垫(3)，其中，荧光微球垫(3)吸附I型HIV抗原标记的荧光微球、II型HIV抗原标记的荧光微球、p24抗体标记的荧光微球和质控蛋白标记的荧光微球，硝酸纤维素膜(8)上在样品垫(2)至吸水垫(9)的方向上有依次吸附I型HIV抗原、II型HIV抗原、p24抗体和抗所述质控蛋白的抗体的三条分离的垂直于样品垫(2)至吸水垫(9)的方向的线。2.前述任一项权利要求所述的测试卡，其中，所述I型HIV抗原的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示；和/或，所述II型HIV抗原的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。3.前述任一项权利要求所述的测试卡，其中，所述质控蛋白的抗原是半抗原；优选所述质控蛋白是DNP-BSA，而且所述质控蛋白的抗体是抗DNP抗体。4.前述任一项权利要求所述的测试卡，其中，所述荧光微球是在波长480nm处有吸收峰的带有羧基基团荧光微球。5.前述任一项权利要求所述的测试卡，其中，所述标记的荧光微球通过如下方法制备：将所述荧光微球与EDC...

【专利技术属性】
技术研发人员：张必新，牛莉娜，李会娜，刘劲林，
申请(专利权)人：苏州华益美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32