本发明专利技术属于分子生物学领域，公开了柑橘黄龙病菌PAP蛋白抗体在制备柑橘黄龙病早期感染检测试剂盒中的应用。利用常规方式制备的PAP蛋白多克隆抗体，经酶联免疫吸附测定（ELISA）方法，测定其工作效价在1：500~1：1000之间。利用PAP多克隆抗体进行ELISA检测，最低能检测到PAP的蛋白含量约为0.005μg。实际应用中，利用制备的PAP多克隆抗体能用于HLB早期感染样品的ELISA检测，且最低能检测到7个病原菌。
【技术实现步骤摘要】
柑橘黄龙病菌PAP蛋白抗体在制备柑橘黄龙病早期感染检测试剂盒中的应用
本申请属于分子生物学领域，具体涉及柑橘黄龙病菌PAP蛋白抗体在制备柑橘黄龙病早期感染检测试剂盒中的应用。
技术介绍
柑橘黄龙病(HLB)是一种严重危害世界柑橘产业的毁灭性病害之一。目前，该病害已经在亚洲、非洲、大洋洲和南北美洲的50多个国家危害和流行。在中国的19个柑橘主产区中，已有11个主产区遭受HLB的危害。柑橘黄龙病由柑橘黄龙病菌感染引起，目前病原菌主要有三种类型，即亚洲型(CandidatusLiberibacterasiaticus)、非洲型(CandidatusLiberibacterafricanus)和美洲型(CandidatusLiberibacteramericanus)。柑橘黄龙病菌是革兰氏阴性菌，属于韧皮部杆菌属(CandidatusLiberibacter)。目前，尚无有效的治疗药剂或理想的抗病品种。预防和减少柑橘黄龙病感染和发生主要通过控制田间木虱媒介，铲除感染黄龙病的植株以及种植健康种苗等方法。其中，种植健康种苗主要依赖于高灵敏的病原早期检测方法。目前，国内外诊断柑橘黄龙病的常规检测手段是基于扩增的分子生物学检测方法，如PCR检测(FujikawaT.etal,2013)、环介导等温扩增技术(LAMP)(OkudaM.etal,2015)、荧光定量PCR检测(LiW.etal,2006)等方法。近年来，国内的专家学者也相继建立了基于蛋白层面的检测技术，如柑橘黄龙病菌Serralysin蛋白多克隆抗体制备(郝俊,2011)和柑橘黄龙病菌外膜蛋白多克隆抗体制备(高玉霞,2015)，但是其制备的抗体主要应用于HLB感染后期的样品检测，未见其在病原早期感染的检测应用。近年来，随着海南绿橙等柑橘类产业的快速发展，柑橘黄龙病危害也随之而来和迅速传播。我们知道，快速和大规模的检测田间病原方法主要依靠蛋白检测技术，如酶联免疫吸附测定(ELISA)方法等。但是，HLB早期感染的植株体内，由于柑橘黄龙病菌含量低且分布不均匀等特点，因此，筛选HLB早期感染时病原菌高表达的基因，制备其抗体，从而建立一种有效和高灵敏的HLB病原检测手段是一种可行的途径。分泌蛋白是指在细胞内合成后，分泌到细胞外起作用的功能蛋白质。柑橘黄龙病菌含有III型和IV型蛋白分泌系统，其分泌的PAP蛋白是组装菌毛的必须组分，其蛋白亚基含量是病原菌的几万倍以上。因此，选择该蛋白作为抗原，制备其抗体，可用于柑橘黄龙病菌早期感染的检测，为柑橘类健康种苗筛选提供一种操作简单，灵敏度高的蛋白检测方法。目前尚无针对柑橘黄龙病菌早期感染检测的商业化蛋白产品。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了柑橘黄龙病菌PAP蛋白抗体在制备柑橘黄龙病早期检测试剂盒中的应用。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：柑橘黄龙病菌PAP蛋白抗体在制备柑橘黄龙病早期检测试剂盒中的应用，所述的柑橘黄龙病菌PAP蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示；所述的抗体包括多克隆抗体或单克隆抗体；所述的检测试剂盒包括但不限于ELISA试剂盒。以上所述的应用中，优选的，所述的柑橘为绿橙。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术的柑橘黄龙病菌PAP多克隆抗体可对早期感染的HLB样品进行检测，检测费用低且灵敏度高；该PAP抗体制备成试剂盒简单，可大规模的应用田间检测。附图说明图1PAP蛋白基因扩增及pET32a-PAP质粒酶切验证；其中，M1:2KDNAMarker；1:PAP蛋白基因PCR扩增；2:M2:15KDNAMarker；2:pET32a-PAP质粒EcoRV和XhoⅠ双酶切。图2PAP融合蛋白的原核表达及可溶性分析；其中，M:ProteinRulerⅣ(30-200kDa)；1:pET32a-PAP/DE3未诱导；2:0.1mMIPTG诱导pET32a-PAP/DE36小时；3:0.1mMIPTG诱导pET32a-PAP/DE3沉淀；4:0.1mMIPTG诱导pET32a-PAP/DE3上清。图3不同浓度咪唑对PAP融合蛋白的洗脱；其中，M:120kDa蛋白Marker；1:上样液；2:清洗液；3:50mM咪唑洗脱；4:100mM咪唑洗脱；5:150mM咪唑洗脱；6:200mM咪唑洗脱；7:250mM咪唑洗脱。图4PAP多克隆抗体的效价检测。图5Westernblot检测PAP抗体的特异性其中，M:蛋白分子量Marker；1:纯化的PAP融合蛋白。图6PAP多克隆抗体最低检出PAP蛋白含量。图7PAP多克隆抗体检测HLB早期感染样品。具体实施方式本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：柑橘黄龙病菌早期感染样品的筛选：1.柑橘黄龙病菌早期感染样品筛选于海南省琼中黎族苗族自治县受HLB感染的绿橙果园中采集无明显症状的15株绿橙植株上的叶片，分别利用CATB法分别提取总DNA(方法参考Wei,S.H.andMeng,N.,2011)，经荧光定量PCR检测，确定其中10株为柑橘黄龙病菌感染，但未表现黄花和斑驳等症状，以此确定为HLB感染的早期样品。实施例2：适用于柑橘黄龙病菌早期检测的目的蛋白筛选：1.柑橘黄龙病菌早期感染样品总RNA制备以实施例1筛选出的10株HLB感染早期样品，按照常规方案提取样品的总RNA。2.柑橘黄龙病菌目的蛋白检测的基因筛选将样品总RNA用PrimeScript反转录酶(TAKARA)合成cDNA第一链。以16SRNA引物作为内参(方法和18SRNA引物参考YanJ.etal,2012)，对多个分泌蛋白基因包括：ATPase(ACT56858.2)、MFP(ACT56859.1)、Serralysin(ACT56857.1)、408(ACT57211.2)、24A(ACT57202.1)、PAP(ACT57200.1)、MSr(ACT57168.1)、MSP(ACT57161.1)、fATP(ACT57157.1)、377(ACT57577.1)等进行荧光定量PCR筛选，从中筛选出表达水平高的目的基因。最终筛选出在柑橘黄龙病菌早期感染中高表达的基因PAP(ACT57200.1)。实施例3：柑橘黄龙病菌PAP蛋白抗体在制备柑橘黄龙病早期检测试剂盒中的应用：本实施例以制备多抗为例进行说明，利用PAP蛋白为抗原制备的单抗，同样适用于柑橘黄龙病的早期检测。1.PAP纯化蛋白的制备：1)PAP蛋白基因的碱基序列确定根据PAP蛋白基因，通过PCR扩增获得该基因的核苷酸序列，获得如SEQIDNo.1所示的碱基序列。2)重组质粒的构建根据pET32a的多克隆位点和PAP蛋白基因的碱基序列设计引物：上游引物：5’-CCGGATATCTTGCATCGTAAGCGCCAAAGAG-3’下游引物：5’-CCGCTCGAGTCCTGACGGGAGGAGAGGAGG-3’扩增以感染HLB的琼中绿橙样品总DNA为模板，扩增反应体系如下：10×PCR反应缓冲液5μL，25mMMgSO42μL，10mMdNTP5μL，10mM正反引物各1μL，基因组DNA模板1μL，TaqDNApolymerase1μL，ddH2O定容至5本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.柑橘黄龙病菌PAP蛋白抗体在制备柑橘黄龙病早期检测试剂盒中的应用，所述的柑橘黄龙病菌PAP蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.柑橘黄龙病菌PAP蛋白抗体在制备柑橘黄龙病早期检测试剂盒中的应用，所述的柑橘黄龙病菌PAP蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示...
【专利技术属性】
技术研发人员：余乃通，刘志昕，李宾宾，杨毅，黎维丽，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46
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