水痘-带状疱疹病毒中和抗体的检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及一种水痘‑带状疱疹病毒中和抗体的检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括重组表达水痘‑带状疱疹病毒糖蛋白E抗原、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、酶标二抗、底物、终止液、标准血清和阴性对照；其中重组表达水痘‑带状疱疹病毒糖蛋白E抗原为优化为大肠杆菌偏爱密码子的VZV‑gE基因与重组表达载体pET‑32a(+)载体连接构建的重组表达质粒转化大肠杆菌，克隆培养并诱导表达的重组蛋白。本发明专利技术的试剂盒所使用的抗原为重组表达水痘‑带状疱疹病毒糖蛋白E抗原，安全性好，不会对环境造成污染。该抗原由基因工程方法制备，专一性强，品质纯，成本相对低廉；抗原位点选择准确，耦合性好，能有效的排除非特异性结合，减小测量误差，降低假阴假阳的出现。

【技术实现步骤摘要】
水痘-带状疱疹病毒中和抗体的检测试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及体外诊断试剂的
，具体是一种水痘-带状疱疹病毒中和抗体的检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
水痘病毒属于疱疹病毒科，病毒粒子呈多边形或球形，外被囊膜，糖蛋白组成的钉状物分布于表面。研究表明，水痘-带状疱疹病毒(VZV)颗粒表面带有7种病毒糖蛋白，这些糖蛋白分别与病毒的侵入、繁殖等感染过程相关。目前用于免疫接种的水痘减毒活疫苗由完整的病毒颗粒组成，疫苗带有全部病毒表面抗原，理论上，接种后可以产生能与所有表面糖蛋白结合的抗体，从而阻断水痘病毒的感染过程。虽然水痘全病毒疫苗可以帮助防止水痘的大规模暴发，但即使在水痘疫苗普及使用的美国，水痘爆发和传播在小学和幼儿园儿童中仍然较为普遍，达到11–17％(最高为40％，oneshot)；在水痘疫苗没有列入免疫规划的中国，这个数据也是惊人的，有文献表明，即使在接种了水痘疫苗的人群中，出现突破病例的比例与国外报道类似。水痘持续小规模暴发表明目前应用的水痘疫苗仍有缺陷，原发性免疫失败和继发性免疫失败的比例较高，需要进一步完善以提高免疫成功率和免疫持久性。病毒疫苗的保护效果与疫苗的免疫原性和机体的状态密切相关，改进疫苗的免疫效力应当从这两个方面开始，即构建具有高度特异性和免疫原性的中和抗原疫苗，同时建立特异性的快速中和抗体检测方法，即时监控免疫效果和免疫状况，釆取补救措施，加強免疫，防止病毒感染和疾病的发生。水痘中和抗体的检测目前主要方法为膜抗原荧光抗体试验(FAMA)，采用全病毒颗粒，可以检测机体内所有抗水痘病毒表面糖蛋白的抗体，但是并非所有外膜糖蛋白都是中和抗原。FAMA法是目前进行血清中抗体检测的金标准，是检测人群VZV抗体水平最佳的方法，可以较准确的确定免疫效果，已经成为评价其他方法的标准。但这种方法操作繁琐，需专业人士在专门的实验室完成，这使FAMA法不适合大批量的检测血清，无法广泛使用。商业化的检测水痘病毒抗体ELISA法试剂盒操作简单、快速，并且可进行大批量检测，因此它是目前使用最为广泛的方法。ELISA检测特异性IgG抗体水平应用广，ELISA间接法具有方法简单、准确度高、无需特殊仪器等特点。但目前市售的ELISA试剂盒采用的是全病毒抗原包被，因此敏感性较差。血清学方法检测水痘-带状疱疹病毒中和抗体对于易感人群的确定和鉴别、水痘疫苗免疫策略的研究以及疫苗免疫效果的评价具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术的上述不足，提供了一种水痘-带状疱疹病毒中和抗体的检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒所使用的抗原为重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原，重组蛋白为非全病毒抗原，安全性好，不含无关杂蛋白，只与水痘-带状疱疹病毒阳性血清特异结合，不与其它病毒阳性血清发生交叉反应，具有良好抗原性，因此具有很高的特异性和敏感性。本试剂盒所使用抗原蛋白包被量较少，所用蛋白浓度仅为3.0-4.0μg/mL。该试剂盒所使用的抗原具有纯度好、免疫原性好、安全性好等优点。本专利技术的第一个目的在于提供一种水痘-带状疱疹病毒中和抗体的检测试剂盒，所述试剂盒包括重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、酶标二抗、底物、终止液、标准血清和阴性对照；所述重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原为优化为大肠杆菌偏爱密码子的VZV-gE基因与重组表达载体pET-32a(+)载体连接构建的重组表达质粒转化大肠杆菌，克隆培养并诱导表达的重组蛋白。进一步地，所述重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原的制备方法为：(1)根据水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E基因序列设计一对扩增引物SEQIDNO.1和SEIDNO.2，通过RT-PCR方法对水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E基因进行扩增，以EcoRI和HindⅢ同时对水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E基因RT-PCR产物和pET-32a(+)载体进行酶切，把所述的基因片段克隆入大肠杆菌DH5a，筛选阳性菌；(2)提取阳性菌质粒转化感受态表达菌BL21(DE3)，得到重组表达菌株；(3)培养所述的重组表达菌株，加入IPTG进行诱导表达，经亲和柱纯化获得所述的重组蛋白。本专利技术的第二个目的在于提供一种基于上述试剂盒的水痘-带状疱疹病毒中和抗体的检测方法，其操作步骤如下：(1)制备重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原；(2)将步骤(1)中制备的重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原稀释为20pg/mL，按20ul/孔加入96孔板的孔中，每孔再加入5～10微升2％～5％的戊二醛溶液，水平震荡96孔板，混匀，室温反应10分钟后孔内溶液凝固，待用；用0.5％牛血清白蛋白30℃封闭2h，洗涤液洗涤，拍干；(3)用样品稀释液将待测样本稀释到合适的浓度，同时用样品稀释液将标准样品进行系列倍比稀释，用于制作标准曲线；所述标准样品来自水痘愈后患者，效价经过VZVIgG国际标准品标定的人抗VZV血清；(4)将稀释好的待测样本与标准样品分别加入96孔板的孔中，1孔加入样品稀释液作为空白对照，2孔加入阴样对照品，所述阴性对照品来自不含抗体的血清；每孔加样100微升，37℃孵育30分钟；(5)用洗涤液清洗96孔板3次，甩干残余洗涤液；(6)每孔加入100微升酶标二抗，振荡混匀，37℃孵育30分钟；(7)重复步骤(5)；(8)每孔加入100微升底物，振荡混匀，37℃孵育10分钟；(9)每孔加入100微升终止液，振荡混匀，使用酶标仪在405nm读取OD值；(10)所有样品的OD值扣减空白对照孔的OD值；(11)根据标准样品的效价和OD值制作标准曲线，将待测样品OD值带入回归方程即可计算出效价。进一步地，所述步骤(1)中重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原的制备方法为：(1)根据水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E基因序列设计一对扩增引物SEQIDNO.1和SEIDNO.2，通过RT-PCR方法对水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E基因进行扩增，以EcoRI和HindⅢ同时对水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E基因RT-PCR产物和pET-32a(+)载体进行酶切，把所述的基因片段克隆入大肠杆菌DH5a，筛选阳性菌；(2)提取阳性菌质粒转化感受态表达菌BL21(DE3)，得到重组表达菌株；(3)培养所述的重组表达菌株，加入IPTG进行诱导表达，经亲和柱纯化获得所述的重组蛋白。进一步地，所述重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原如SEQNO.3所示。进一步地，所述步骤(3)样品稀释液为pH＝9.5的0.5mol/L碳酸盐缓冲液，其中添加质量浓度为1％的牛血清白蛋白。进一步地，所述步骤(5)中洗涤液为含0.1％吐温-20、1％牛血清白蛋白、pH7.4的PBST洗涤液。进一步地，所述步骤(6)中酶标二抗为含20mmol/L磷酸盐、牛血清白蛋白1％、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG。进一步地，所述步骤(8)中底物为：含2mg/ml3，3'，5，5'-四甲基联苯胺的无水乙醇溶液1.56ml、50mmol/L磷酸氢二钠-25mmol/L枸橼酸缓冲液31.25ml、0.75％过氧化氢溶液0.1ml，混匀。进一步地，所述步骤(9)中终止液为2mol/L硫酸。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术的试剂盒所使用的抗原为重组表达水痘-带状疱疹本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水痘‑带状疱疹病毒中和抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括重组表达水痘‑带状疱疹病毒糖蛋白E抗原、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、酶标二抗、底物、终止液、标准血清和阴性对照；所述重组表达水痘‑带状疱疹病毒糖蛋白E抗原为优化为大肠杆菌偏爱密码子的VZV‑gE基因与重组表达载体pET‑32a(+)载体连接构建的重组表达质粒转化大肠杆菌，克隆培养并诱导表达的重组蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种水痘-带状疱疹病毒中和抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、酶标二抗、底物、终止液、标准血清和阴性对照；所述重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原为优化为大肠杆菌偏爱密码子的VZV-gE基因与重组表达载体pET-32a(+)载体连接构建的重组表达质粒转化大肠杆菌，克隆培养并诱导表达的重组蛋白。2.根据权利要求1所述的一种水痘-带状疱疹病毒中和抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原的制备方法为：(1)根据水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E基因序列设计一对扩增引物SEQIDNO.1和SEIDNO.2，通过RT-PCR方法对水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E基因进行扩增，以EcoRI和HindⅢ同时对水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E基因RT-PCR产物和pET-32a(+)载体进行酶切，把所述的基因片段克隆入大肠杆菌DH5a，筛选阳性菌；(2)提取阳性菌质粒转化感受态表达菌BL21(DE3)，得到重组表达菌株；(3)培养所述的重组表达菌株，加入IPTG进行诱导表达，经亲和柱纯化获得所述的重组蛋白。3.一种基于权利要求1-2任一项所述试剂盒的水痘-带状疱疹病毒中和抗体的检测方法，其特征在于，其操作步骤如下：(1)制备重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原；(2)将步骤(1)中制备的重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原稀释为20pg/mL，按20ul/孔加入96孔板的孔中，每孔再加入5～10微升2％～5％的戊二醛溶液，水平震荡96孔板，混匀，室温反应10分钟后孔内溶液凝固，待用；用0.5％牛血清白蛋白30℃封闭2h，洗涤液洗涤，拍干；(3)用样品稀释液将待测样本稀释到合适的浓度，同时用样品稀释液将标准样品进行系列倍比稀释，用于制作标准曲线；所述标准样品来自水痘愈后患者，效价经过VZVIgG国际标准品标定的人抗VZV血清；(4)将稀释好的待测样本与标准样品分别加入96孔板的孔中，1孔加入样品稀释液作为空白对照，2孔加入阴样对照品，所述阴性对照品来自不含抗体的血清；每孔加样100微升，37℃孵育30分钟；(5)用洗涤液清洗96孔板3次，甩干残余洗涤液；(6)每孔加入100微升酶标二抗，振荡混匀，37℃孵育30分钟；(7)重复步骤(5)；(8)每...

【专利技术属性】
技术研发人员：王诺，曾强，彭芳霁，黄晶，吴边，谢张婷，徐云，尹新涛，丁建华，张薇，尹碧，
申请(专利权)人：武汉生命科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42