人T淋巴细胞病毒(HTLV)抗体检测试剂盒及其应用和制备制造技术

本发明专利技术提供了人T淋巴细胞病毒(HTLV)抗体的检测试剂盒，其包括：用HTLV‑I型和II型病毒的抗原标记的磁微粒、与HTLV‑I型和II型病毒的抗原偶联的吖啶酯、阴性对照、第一阳性对照和第二阳性对照。本发明专利技术还提供了该试剂盒的应用和制备方法等。

Human T lymphocyte virus (HTLV) antibody detection kit and its application and preparation

The present invention provides a human T lymphotropic virus (HTLV) antibody detection kit, which comprises: using HTLV I type and II type virus antigen labeled with HTLV, magnetic particle type I and type II virus antigen coupled acridiniumester, negative control, positive control and positive control of the first second. The invention also provides the application and the preparation method of the kit.

【技术实现步骤摘要】
人T淋巴细胞病毒(HTLV)抗体检测试剂盒及其应用和制备
本专利技术属于免疫检测
，具体而言，本专利技术涉及人T淋巴细胞病毒(HTLV)抗体的检测试剂盒及其应用和制备方法等。
技术介绍
人T淋巴细胞病毒(HTLV)，属慢病毒亚科，可分为HTLV-Ⅰ型和HTLV-Ⅱ型。其中，HTLV-Ⅰ可引起成人T细胞病/淋巴瘤(adultT-cellleukemia/lymphoma，ATL)、热带痉挛性截瘫/HTLV相关性脊髓病(tropicalspasticparaparesis/HTLV-associatedmyelopathy)等，HTLV-Ⅱ与T-多毛细胞/巨粒细胞病(T-hairycell/largegranulocyticleukemia)等疾病相关。除了传统的细胞学检查外，早期对血清HTLV-I/Ⅱ抗体检测多采用间接免疫荧光法(IFA)、明胶颗粒凝集反应(GPA)、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)及蛋白印迹试验(WB)等来进行。但是由于基于抗原、抗体的免疫检测操作较为繁琐，过程不容易标准化，检测灵敏度低，容易出现假阴性结果，所以近年来，对HTLV的检测逐渐倾向于用基于核酸的PCR法来检测，例如，中国专利申请CN103898239A公开了一种同管检测HTLV-I和HTLV-II前病毒的引物和方法，其通过实时PCR来对样本进行检测；又如，中国专利申请CN105886665公开了一种B19、HTLV和HEV的四重荧光PCR的快速超敏检测，也是利用了实时PCR。然而，本专利技术人发现，由于PCR的灵敏度太高，而检测实验室难免不受各种检测样品的污染，即使进行消毒，也很难完全去除HTLV的病毒核酸片段，因此造成不少假阳性结果，容易引起纠纷。为此，本专利技术人凭借长期在本领域深耕的经验，在经历大量实验失败的基础上，发现要开发HTLV-I和HTLV-II同时适用的高灵敏度、高精确度、高可靠性并且检测方便迅速的免疫分析方法，需用多方面的协同改进，包括抗原的设计，抗原载体的选择，显示(发光)标记物的制备，以及阴性对照和阳性对照等。本专利技术人最终开发出了检测人T淋巴细胞病毒(HTLV)抗体的检测试剂盒，其不但灵敏度高、可靠性好，不易受人为操作因素影响，能够用于确证其他方法误检的疑难样品，而且操作方便迅速，操作便于标准化，可用于急诊检测等。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供一种HTLV-I和HTLV-II同时适用的高灵敏度、高精确度、高可靠性并且检测方便迅速的检测试剂盒及其免疫分析HTLV-I和HTLV-II抗体中的应用和其中的试剂的制备方法等。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了同时检测样品中HTLV-I型和II型病毒抗体的免疫检测试剂盒，其包括：(1)第一容器，其中容纳用HTLV-I型和II型病毒抗原标记的磁微粒；(2)第二容器，其中容纳与HTLV-I型和II型病毒抗原偶联的吖啶酯；(3)第三容器，其中容纳阴性对照；(4)第四容器，其中容纳第一阳性对照；和(5)第五容器，其中容纳第二阳性对照。在本文中，样品是潜在可能含有HTLV-I型和/或II型病毒抗体的离体样品，如血液、血液制品、体液等。本专利技术的检测方法所针对的目标——病毒抗体，是人体免疫系统应对HTLV-I型和/或II型自然产生的(多克隆)抗体。在本专利技术的具体实施方式中，可以同时检测HTLV-I型和II型的病毒抗体。这些抗体能够在一定程度上表征HTLV-I型和II型病毒的存在性。需要指出的是，本专利技术的检测用于对离体样品的检测，检测的直接结果是抗体的存在性与否，而并非诊断结果。即使对于利用本专利技术的检测方法检测人的血液样品中HTLV-I型和/或II型病毒抗体，也只能直接得出抗体的存在与否，还需要有经验的医生根据相应人的体质、病史、临床症状等综合情况才能判断出检测出的相应抗体已经遏制了病毒或不足以抵抗病毒的诊断结果或健康状况。因此无法根据抗体的存在而直接判断其携带者是否患有由HTLV-I型和/或II型病毒带来的疾病，所以本专利技术直接目的不是诊断。所以，本专利技术的试剂盒的应用不属于诊断方法。在本文中，HTLV-I和HTLV-II可以分别同HTLV-1和HTLV-2互换使用，分别指的是人T淋巴细胞病毒(HTLV)的两种亚型，这是本领域技术人员所熟知的。在本文中，“第一”、“第二”等序数词仅仅是对具有相同或相似用途的物品或物质的区分，并不对物品或物质的结构、组成、性质和形状等构成限定。例如，第四容器和第五容器可以是材料、形状完全相同的容器，但是是不同的容器，分别容纳第一阳性对照和第二阳性对照。容器可以是瓶、管或杯，使得其中的容纳物被分隔保存。优选在本专利技术第一方面的试剂盒中，HTLV-I型和II型病毒抗原的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术人设计的该抗原能方便地连接于发光标记物和磁微粒上，仍旧保持效价高、特异性好的优势，并且涵盖了HTLV-I型和II型的测定。该抗原能够通过本领域技术人员所熟知的重组方法生产，当前已经有商业渠道提供重组生产蛋白(抗原)的服务。优选在本专利技术第一方面的试剂盒中，磁微粒是粒径0.90-1.10μm的含有羧基基团的磁微粒。本专利技术人研究发现这样的磁微粒对本专利技术的抗原的标记率高，施加磁力后聚集迅速，并且吸附一致性好。在本专利技术的具体实施方式中，磁微粒是EM1-40/100型号的磁微粒。更优选在本专利技术第一方面的试剂盒中，用HTLV-I型和II型病毒的抗原标记的磁微粒的制备方法包括：将EDC和NHS混合溶于MES中，加入磁微粒，震荡，弃上清液，清洗后加入HTLV-I型和II型病毒抗原进行标记反应，然后加入赖氨酸封闭，再洗涤。优选在本专利技术第一方面的试剂盒中，吖啶酯是吖啶琥珀酰亚胺酯。本专利技术人研究发现该吖啶酯基本不影响本专利技术的抗原的效价，而且发光好。更优选在本专利技术第一方面的试剂盒中，与HTLV-I型和II型病毒的抗原偶联的吖啶酯的制备方法包括：将吖啶琥珀酰亚胺酯的DMF溶液与HTLV-I型和II型病毒抗原的PB溶液混合，搅拌后加入赖氨酸封闭，再透析。优选在本专利技术第一方面的试剂盒中，阴性对照是HTLV抗体检测确认呈阴性的人血清；第一阳性对照是HTLV-I抗体检测确认呈阳性的人血清，优选是HTLV-I抗体检测确认呈阳性但HTLV-II抗体检测确认呈阴性的人血清；和，第二阳性对照是HTLV-II抗体检测确认呈阳性的人血清，优选是HTLV-II抗体检测确认呈阳性但HTLV-I抗体检测确认呈阴性的人血清。本专利技术人发现，由于操作人员水平的参差不齐，所以会出现带有倾向性的检测结果，通过设置这些对照，并且配合阈值判读，可以有效避免检测结果受人为操作因素的影响。在本专利技术的具体实施方式中，人血清是在60℃保温1小时后过滤除菌而制备得到的。各人血清可在知情同意下由相应人员捐赠，也可购自疾控中心。在本文中，“任选”具有辞典意义，即涵盖选或不选两种情况的范围。本专利技术第一方面的试剂盒任选还包括分别容纳洗液、第一激发液、第二激发液、磁微粒稀释液和/或吖啶酯偶联物稀释液的容器，即可以包括这些容器，也可以不包括这些容器。在本专利技术的具体实施方式中，本专利技术第一方面的试剂盒还包括分别容纳洗液、第一激发液、第二激发液、磁微粒稀释液和/或吖啶酯偶联物稀释液的容器。更优选在本专利技术第本文档来自技高网...

【技术保护点】
同时检测样品中HTLV‑I型和II型病毒抗体的免疫检测试剂盒，其包括：(1)第一容器，其中容纳用HTLV‑I型和II型病毒的抗原标记的磁微粒；(2)第二容器，其中容纳与HTLV‑I型和II型病毒的抗原偶联的吖啶酯(优选为吖啶琥珀酰亚胺酯)；(3)第三容器，其中容纳阴性对照，优选阴性对照是HTLV抗体检测确认呈阴性的人血清；(4)第四容器，其中容纳第一阳性对照，优选第一阳性对照是HTLV‑I型抗体检测确认呈阳性的人血清；和(5)第五容器，其中容纳第二阳性对照，优选第二阳性对照是HTLV‑II型抗体检测确认呈阳性的人血清；还任选包括分别容纳洗液、第一激发液、第二激发液、磁微粒稀释液和/或吖啶酯偶联物稀释液的容器。

【技术特征摘要】
1.同时检测样品中HTLV-I型和II型病毒抗体的免疫检测试剂盒，其包括：(1)第一容器，其中容纳用HTLV-I型和II型病毒的抗原标记的磁微粒；(2)第二容器，其中容纳与HTLV-I型和II型病毒的抗原偶联的吖啶酯(优选为吖啶琥珀酰亚胺酯)；(3)第三容器，其中容纳阴性对照，优选阴性对照是HTLV抗体检测确认呈阴性的人血清；(4)第四容器，其中容纳第一阳性对照，优选第一阳性对照是HTLV-I型抗体检测确认呈阳性的人血清；和(5)第五容器，其中容纳第二阳性对照，优选第二阳性对照是HTLV-II型抗体检测确认呈阳性的人血清；还任选包括分别容纳洗液、第一激发液、第二激发液、磁微粒稀释液和/或吖啶酯偶联物稀释液的容器。2.权利要求1所述的试剂盒，其中，HTLV-I型和II型病毒的抗原的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。3.权利要求1所述的试剂盒，其中，磁微粒是粒径0.90-1.10μm的含有羧基基团的磁微粒。4.权利要求1所述的试剂盒，其中，用HTLV-I型和II型病毒抗原标记的磁微粒的制备方法包括：将EDC和NHS混合溶于MES中，加入磁微粒，震荡，弃上清液，清洗后加入HTLV-I型和II型病毒的抗原进行标记反应，然后加入赖氨酸封闭，再洗涤。5.权利要求1所述的试剂盒，其中，与HTLV-I型和II型病毒抗原偶联的吖啶酯的制备方法包括：将吖啶琥珀酰亚胺酯的DMF溶液与HTLV-I型和II型病毒抗原的PB溶液混合，搅拌后加入赖氨酸封闭，再透析。6.权利要求1所述的试剂盒，其中，人血清是在60℃保温1小时后过滤除菌而得的。...

【专利技术属性】
技术研发人员：付昕，李会娜，王川，牛莉娜，郭兰英，叶成果，张鑫，步阳阳，
申请(专利权)人：苏州华益美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32