基于核酸层析生物传感技术检测阪崎肠杆菌的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于核酸层析生物传感技术检测阪崎肠杆菌的方法，根据阪崎肠杆菌的毒力基因ompA，设计环介导等温扩增引物(SEQ ID NO:1‑4)，结合纳米酶核酸试纸条，建立一种基于LAMP纳米酶传感器的阪崎肠杆菌检测方法。本方法可成功地用于区分活菌细胞和死菌细胞，对阪崎肠杆菌的检测下限可达10CFU/mL。

Nucleic acid chromatography based biosensing technique for detection of Enterobacter cloacae

The invention relates to a method for detection of Enterobacter sakazakii nucleic acid chromatography biological sensing technology based on ompA, according to the virulence gene of Enterobacter sakazakii, design of loop mediated isothermal amplification (SEQ ID NO:1 primer 4), combined with nano enzyme nucleic acid strip, to establish a detection method of Enterobacter sakazakii LAMP nanoparticles the enzyme sensor based on. This method can be successfully used to distinguish viable and dead bacteria cells, and the detection limit can be up to 10CFU/mL.

【技术实现步骤摘要】
基于核酸层析生物传感技术检测阪崎肠杆菌的方法
本专利技术涉及生物传感检测
，具体地说，涉及一种基于核酸层析生物传感技术检测阪崎肠杆菌的方法。
技术介绍
阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)是一种革兰氏阴性、依靠周生鞭毛运动、无芽孢的兼性厌氧细菌。它是肠杆菌属的一种条件致病菌，该菌引起的食源性疾病可导致婴儿(尤其是新生儿)的脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，报告病例的死亡率达20％-50％，幸存者常遗留严重的神经系统疾病。近年来对食品(奶粉、巧克力、谷类食品、马铃薯、意大利面等)加工厂原料、生产环境及家庭中阪崎肠杆菌污染率的研究发现，阪崎肠杆菌在自然界中分布广泛。在多起阪崎肠杆菌的暴发事件中发现，新生儿阪崎肠杆菌感染与婴儿配方粉密切相关。传统的细菌检测方法主要根据生理生化特征，但是传统的检测方法需要经过前增菌、选择性平板分离、生物化学鉴定等步骤，从取样到确定结果需要5-7天，检测周期长，操作繁琐，工作量大；利用抗原抗体反应的特异性，对细菌进行鉴别，已有半个多世纪的历史，但是微生物抗体的筛选十分繁琐，并且最终的检测特异性不高；分子生物学检测技术的不断完善和发展，克服了传统检测方法实验操作繁琐、耗时长等问题，也使得针对微生物开展的快速检测方法得到迅速发展，但是分子生物学方法的缺点在于不容易分析结果。随着现代生物技术的发展，比传统方法更快捷、更灵敏的生物传感器新技术在食品安全检测领域崭露头角。生物传感器具备特异性强、灵敏度高等优点，可以简化分析检测步骤，缩短分析时间，更重要的是使在线实时检测成为可能，便于携带和野外作业，在食品安全领域得到了较快的发展。近年来，众多新材料、新技术的开发和应用正成为研究的热点，为生物传感器的发展注入了新的活力，在微生物检测领域显示出巨大的应用潜力。因此建立阪崎肠杆菌可靠的、快速的传感器检测方法，特别是能够鉴定死活菌的方法，在日常监控、市场筛查等方面具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于核酸层析生物传感技术检测阪崎肠杆菌的方法。本专利技术构思如下：开发一种阪崎肠杆菌的快速和超灵敏检测方法，特别是能够鉴定死活菌的方法，建立基于叠氮碘化丙啶(PMA)，环介导等温扩增反应(LAMP)和纳米酶试纸的活菌检测的连续级联纳米酶生物传感器。在LAMP反应中，使用荧光素(FITC)修饰的和生物素(BIO)修饰的引物测定阪崎肠杆菌的ompA基因。将PMA与LAMP组合，应用于死活阪崎肠杆菌的分离。然后，使用纳米酶探针制备基于磁性颗粒的免疫层析条(纳米酶条)用于检测扩增信号，通过目视检测或利用条形读出器进行结果判读或定量，为现场检测阪崎肠杆菌活菌提供快速、超灵敏和便捷的工具。为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供用于检测阪崎肠杆菌(EnterobacterSakazakii)的LAMP引物组，包括(SEQIDNO:1-4)：外侧正向引物F3：5’-TGGTCCCAGTTCCACGATA-3’；外侧反向引物B3：5’-ACGCCCTGAGCTTTGAAAG-3’；内侧正向引物FIP：5’-TAACCTGGTAACCACCGAACGCTATTCCTAACGACGGTCCGA-3’；内侧反向引物BIP：5’-GTACGTTGGCTTCGAAATGGGCCAGTGTCGCCTTTATACGGC-3’。其中，引物FIP的5’端标记生物素，引物BIP的5’端标记荧光素FITC。本专利技术还提供一种纳米酶核酸层析试纸条，所述试纸条的制备方法包括以下步骤：1)Fe3O4磁颗粒的制备；2)纳米酶探针(MNP)的制备：将Fe3O4磁颗粒与生物素二抗进行孵育，得到生物素二抗纳米酶探针；3)纳米酶核酸层析试纸条的组装：所述试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中，所述硝酸纤维素膜上设有至少1条检测线和1条质控线；所述结合垫上固定有生物素二抗纳米酶探针；①分别用FITC抗体和生物素抗体在硝酸纤维素膜上划出检测线和质控线，烘干；②将上述样品垫、结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜以及吸收垫依次粘贴在底板(塑料衬板)上，完成试纸条的组装。组装好的试纸条的结构示意图见图5。步骤1)中利用水热法合成Fe3O4磁颗粒，具体为：将0.6-0.8gFeCl3·6H2O溶解在20mL乙二醇中，然后加入1.5-2.0g醋酸钠，剧烈搅拌30-40min，然后密封在高压釜中，200℃加热16-18h；磁颗粒产物用乙醇洗涤几次，并在60℃下干燥；将二氯乙烷和N-羟基琥珀酰亚胺各5-8mg通过涡旋溶解在1mL去离子水中，制得混合液，然后将5-8mg磁颗粒加入混合液中，室温下孵育30-40min，然后用磁铁收集磁颗粒，用超纯水洗涤两次，即得Fe3O4磁颗粒。步骤2)具体为：将浓度100μg/mL的生物抗体加入50mMpH6.0的醋酸钠缓冲液中，然后与5-8mg的Fe3O4磁颗粒混合，将混合物涡旋混合，4℃孵育过夜；用pH7.0的PBS液洗涤两次混合物，然后在50mMpH7.2的Tris缓冲液中室温孵育30min；再用pH7.0的PBS液洗涤，即得到生物素二抗纳米酶探针。步骤3)中检测线设在距硝酸纤维素膜下边缘1.1cm的位置上，质控线设在距硝酸纤维素膜下边缘1.6cm的位置上。检测线与质控线之间的距离为4.5mm。按1.0μL/cm将FITC抗体和生物素抗体分别喷涂在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上。其中检测线和质控线上包被的抗体的浓度均为0.5-2mg/mL。抗体的最佳浓度为1mg/mL。本专利技术中使用的生物素抗体购自Sigma公司，商品编号B7653，FITC抗体购自Sigma公司，商品编号F5636。生物素二抗为羊抗鼠IgG。所用硝酸纤维素膜为Millipore135S。在本专利技术的一个优选实施方式中，所述纳米酶核酸层析试纸条的制备如下：步骤1)中利用水热法合成Fe3O4磁颗粒，具体为：将0.6gFeCl3·6H2O溶解在20mL乙二醇中，然后加入1.5g醋酸钠，剧烈搅拌30min，然后密封在高压釜中，200℃加热16h；磁颗粒产物用乙醇洗涤几次，并在60℃下干燥；将二氯乙烷和N-羟基琥珀酰亚胺各5mg通过涡旋溶解在1mL去离子水中，制得混合液，然后将5mg磁颗粒加入混合液中，室温下孵育30min，然后用磁铁收集磁颗粒，用超纯水洗涤两次，即得Fe3O4磁颗粒。步骤2)具体为：将浓度100μg/mL的生物素二抗加入50mMpH6.0的醋酸钠缓冲液中，然后与5mg的Fe3O4磁颗粒混合，将混合物涡旋混合，4℃孵育过夜；用pH7.0的PBS液洗涤两次混合物，然后在50mMpH7.2的Tris缓冲液中室温孵育30min；再用pH7.0的PBS液洗涤，即得到生物素二抗纳米酶探针。最后将纳米酶探针分散到1mL的5％BSA-PBS溶液中。使用JEOL2000FX200kV透射电子显微镜(TEM)观察纳米酶探针的粒径，MNP的尺寸分布显示平均直径为200nm，可用于纳米酶传感器的构建。将样品垫、固定有生物素二抗纳米酶探针的结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜以及吸收垫依次粘贴在底板上，即完成试纸条的组装。本专利技术还提供基于核酸层析生物传感技术检测阪崎肠杆菌的方法，包括以下步骤：S1、提取待测样品DNA，以DNA为模板，利用上述LAMP引物组进行LAM本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测阪崎肠杆菌(Enterobacter Sakazakii)的LAMP引物组，其特征在于，包括：外侧正向引物F3：5’‑TGGTCCCAGTTCCACGATA‑3’；外侧反向引物B3：5’‑ACGCCCTGAGCTTTGAAAG‑3’；内侧正向引物FIP：5’‑TAACCTGGTAACCACCGAACGCTATTCCTAACGACGGTCCGA‑3’；内侧反向引物BIP：5’‑GTACGTTGGCTTCGAAATGGGCCAGTGTCGCCTTTATACGGC‑3’；其中，引物FIP的5’端标记生物素，引物BIP的5’端标记荧光素FITC。

【技术特征摘要】
1.用于检测阪崎肠杆菌(EnterobacterSakazakii)的LAMP引物组，其特征在于，包括：外侧正向引物F3：5’-TGGTCCCAGTTCCACGATA-3’；外侧反向引物B3：5’-ACGCCCTGAGCTTTGAAAG-3’；内侧正向引物FIP：5’-TAACCTGGTAACCACCGAACGCTATTCCTAACGACGGTCCGA-3’；内侧反向引物BIP：5’-GTACGTTGGCTTCGAAATGGGCCAGTGTCGCCTTTATACGGC-3’；其中，引物FIP的5’端标记生物素，引物BIP的5’端标记荧光素FITC。2.一种纳米酶核酸层析试纸条，其特征在于，所述试纸条的制备方法包括以下步骤：1)Fe3O4磁颗粒的制备；2)纳米酶探针的制备：将Fe3O4磁颗粒与生物素二抗进行孵育，得到生物素二抗纳米酶探针；3)纳米酶核酸层析试纸条的组装：所述试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中，所述硝酸纤维素膜上设有至少1条检测线和1条质控线；所述结合垫上固定有生物素二抗纳米酶探针；①分别用FITC抗体和生物素抗体在硝酸纤维素膜上划出检测线和质控线，烘干；②将上述样品垫、结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜以及吸收垫依次粘贴在底板上，完成试纸条的组装。3.根据权利要求2所述的试纸条，其特征在于，步骤1)中利用水热法合成Fe3O4磁颗粒，具体为：将0.6-0.8gFeCl3·6H2O溶解在20mL乙二醇中，然后加入1.5-2.0g醋酸钠，搅拌30-40min，然后密封在高压釜中，200℃加热16-18h；磁颗粒产物用乙醇洗涤，并在60℃下干燥；将二氯乙烷和N-羟基琥珀酰亚胺各5-8mg通过涡旋溶解在1mL去离子水中，制得混合液，然后将5-8mg磁颗粒加入混合液中，室温下孵育30-40min，然后用磁铁收集磁颗粒，用超纯水洗涤，即得Fe3O4磁颗粒。4.根据权利要求3所述的试纸条，其特征在于，步骤2)具体为：将浓度100μg/mL的生物素二抗加入50mMpH6.0的醋酸钠缓冲液中，然后与5-8mg的Fe3O4磁颗粒混合，将混合物涡旋混合，4℃孵育过夜；用pH7.0的PBS液洗涤混合物，然后在50mMpH7.2的Tris缓冲液中室温孵育30-40min；再用pH7.0的PBS液洗涤，即得到生物素二抗纳米酶探针。5.根据权利要求2所述的试纸条，其特征在于，步骤2)和3)中所述的生物素二...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗云波，许文涛，黄昆仑，徐瑗聪，张莉，程楠，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11