A breeding source of Enterococcus faecium indirect ELISA method, which belongs to the technical field of microbial detection, more sheep source Enterococcus faecium indirect ELISA method for detection of specific reagent preparation process and monitoring method comprises the following steps: the optimal working conditions of serum preparation, immune activation, Acm antigen preparation, ELISA method.
【技术实现步骤摘要】
一种羊源屎肠球菌间接ELISA检测方法
本专利技术属于微生物检测
，具体是一种羊源屎肠球菌间接ELISA检测方法。
技术介绍
近几年的研究表明，肠球菌已是医院流行的主要病原体。美国医院感染监视系统(NISS)已将其列为医院感染的第二大病原菌，检出率仅次于大肠杆菌。有资料统计，在引起尿路感染的致病菌中，肠球菌感染居第2位；腹腔、盆腔感染，肠球菌居第3位；败血症，肠球菌居第3位，病死率12.6％～57％。在肠球菌所致感染中屎肠球菌的比例占到近一半。在动物方面，近年来，屎肠球菌感染动物，导致动物发病死亡的病例日益增多，并造成人畜共患，其严重性在日益增强。屎肠球菌作为重要的条件性致病菌已给人类和养殖业造成严重损失，尽管在一些肠球菌的病原学、致病机理、耐药机制、诊断等方面有大量研究，但是对屎肠球菌致病机理和耐药机制，尤其是诊断和治疗方法的研究还非常欠缺。屎肠球菌感染主要依靠实验室细菌分离、PCR分子生物学鉴定，在基层则缺乏快速有效的屎肠球菌血清学诊断方法。血清学诊断方法的缺乏，可能使得基层对屎肠球菌感染造成误诊及漏诊，从而对畜牧业生产造成不必要的损失。现有的间接血凝(IHA)检测方法(申请号或专利号：201610382656.3)特异性不高，敏感性较差。国内曾以粪肠球菌胶原蛋白黏附素(Ace)蛋白为抗原建立了猪源粪肠球菌ELISA检测方法。屎肠球菌胶原蛋白粘附素(adhesinofcollagenfromE.faecium,Acm)蛋白在屎肠球菌中也具有特异性，故本研究通过构建pET-32a-Acm表达载体，原核表达屎肠球菌Acm蛋白，以此作为抗原建立羊源(绵...
【技术保护点】
一种羊源屎肠球菌间接ELISA检测方法，其特征在于：所述检测方法中用到试剂的Acm蛋白序列为：DAGRDISSNVTSLTVDPTNITDGGNIKVKFSFDEKKQNIQPGDYLWINWPSEGNIRGEGFQKEIPLMIENKNVGTLTVRKDSAQVVFNENIKNLDSVEGWGQFEIQARNVTDTGEENTGPFTVTSGDKTATVNVTKPASGSSSSVFYYKTGDMLPEDTKHIRWFLNINNNGTYVEQPVKISDEIQSGQRLDPSTFEINQIHLGEQKVYRGEEGIQQFLQDFPGATFNFSVTDNYIEITIPKNFVNLRKIMVSYKTIIENPEQINFENHSEAWFKEFNKPAVDGESFNHTVKNISASGGVNGTVRGELKIFKYINDTEIGIPNVTFELRRADEQPIQGQSSILLTSNEQGEASIKGLQVGDYVVKEKEAPNWIDFDPLSSNELKFSINENDTEGVSLPIYNKKKVTNITATKIWNGGTTPRPSIYFKLFRASTNNWEPVPDAETKRLDNGITSV...
【技术特征摘要】
1.一种羊源屎肠球菌间接ELISA检测方法，其特征在于：所述检测方法中用到试剂的Acm蛋白序列为：DAGRDISSNVTSLTVDPTNITDGGNIKVKFSFDEKKQNIQPGDYLWINWPSEGNIRGEGFQKEIPLMIENKNVGTLTVRKDSAQVVFNENIKNLDSVEGWGQFEIQARNVTDTGEENTGPFTVTSGDKTATVNVTKPASGSSSSVFYYKTGDMLPEDTKHIRWFLNINNNGTYVEQPVKISDEIQSGQRLDPSTFEINQIHLGEQKVYRGEEGIQQFLQDFPGATFNFSVTDNYIEITIPKNFVNLRKIMVSYKTIIENPEQINFENHSEAWFKEFNKPAVDGESFNHTVKNISASGGVNGTVRGELKIFKYINDTEIGIPNVTFELRRADEQPIQGQSSILLTSNEQGEASIKGLQVGDYVVKEKEAPNWIDFDPLSSNELKFSINENDTEGVSLPIYNKKKVTNITATKIWNGGTTPRPSIYFKLFRASTNNWEPVPDAETKRLDNGITSVTWEDIQQYDDSGNEYTFKVQEVDQNGNDYVPSGYQKIENGLVVTNENK。2.根据权利要求1所述的一种羊源屎肠球菌间接ELISA检测方法，具体操作包括如下步骤：血清制备：第一步，病原菌的扩大培养：将配制的THB液体培养基121摄氏度高压灭菌15分钟，冷却后于超净工作台内分装至200毫升的培养瓶中，每瓶中装入180mlTHB培养液；然后向200毫升培养瓶中接入1毫升预先制备的病原菌菌液，将接入菌液的培养瓶放入摇床，37摄氏度、180转/分钟震荡培养12～24小时后收集菌体；第二步，灭活：以福尔马林作为化学灭活剂，灭活前先确定福尔马林对病原菌的安全灭活浓度，具体操作时先取多支试管，分别向所有支试管内加入5毫升预先制备的病原菌菌液，取用部分试管作为对照组，其余为实验组，向实验组试管内加入一定量的福尔马林，福尔马林加入终浓度从0.1％至1.0％；将所有试管置于4摄氏度环境中放置24小时，放置结束后分别从每支试管中取出0.2毫升菌液，涂抹于THB琼脂平板上，在37摄氏度环境中培养48小时，检测各试管内细菌的存活情况，只有没有细菌生长的对应福尔马林浓度才是该病原菌的灭活安全浓度；检测结果显示，各菌的福尔马林安全灭活终浓度均为0.6％；依照以上安全浓度，对稀释的菌液进行灭活处理；第三步，安全性检测：取0.2毫升灭活菌液涂抹于THB琼脂平板上，在37摄氏度环境中培养48小时，只有在琼脂平板上没有出现菌落出现才说明灭活彻底，灭活菌液中确实没有活菌存在；将所制备的灭活菌液稀释成疫苗接种所用的浓度(107-108菌落形成单位)，用注射法将稀释后的灭活菌液接种到无患病史的同种寄主动物体内，经20d观察无发病或死亡才说明该灭活细菌是安全的；第四步，乳化：将灭活菌液、佐剂加入烧杯，灭活菌液与佐剂重量比为1:1，用水浴锅将装有灭活菌液、佐剂的烧杯加热至30～31摄氏度，期间伴随搅拌，搅拌器距烧杯底部10毫米；乳化器转速5000转/分，进行4分钟；停止搅拌后，将烧杯内的液体置于20摄氏度环境中1小时；最后将制备的乳液分装，并余留一部分，将余留乳液置于20摄氏度环境中24小时后质检；第五步，质量检验：剂型检验，用吸管吸取疫苗，滴几滴于水中，观察是否分散；粒度检验，用显微镜直接观察颗粒是否均匀；稳定性检验，在一个半径为10厘米的离心器中装入乳液，用离心机3000转/分钟，离心15分钟不分层，相当于保存1年以上不破乳；粘度检验，取内口直径为1.2毫米的吸管，在室温下吸满1毫升乳液，垂直放出0.4毫升所需时间作为粘度单位，以2～6秒为合格，不得多余10～15秒；无菌检验，取灭活苗1毫升，接种于T.G培养基上，于37摄氏度环境中培养72小时，之后吸取培养物，分别接种于T.G和G.A斜面，每支0.2毫升，一支置于37摄氏度环境中，一支置于25摄氏度环境中，另取0.2毫升接种于G.P培养基，于2525摄氏度环境中120小时，观察是否有细菌生长；安全性检验，取10只18～20克的小白鼠，每只腹腔注射疫苗1毫升，观察21日，小白鼠未死亡算合格；免疫激活：在采集受测健康绵羊的血样，即对照阴性血样，之后对受测绵羊进行两次颈部皮下血清注射，两次注射间隔3周，第二次注射后15天进行静脉攻毒，每只羊攻毒剂量为3×109菌落形成单位，然后每隔1周采集一次受测绵羊的阳性血清；Acm抗原制备：所用材料试剂来源：AxyPrepDNAGelExtractionKit购自爱思进生物技术(杭州)有限公司；磁珠法基因DNA抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；pUC57-Kan载体、Pfu聚合酶、PremixT...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘永生，李学瑞，刘永安，周建华，马丽娜，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62
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