无创产前诊断胎儿非整倍体性的方法和组合物技术

本发明专利技术提供胎儿非整倍体性无创产前诊断的方法和组合物。识别了多种差异甲基化区域(DMR)。某些所述的DMR在成人女性血液DNA中低甲基化，在胎儿DNA中高甲基化；而其它的在成年女性血液DNA高甲基化，在胎儿DNA低甲基化。此外，在成人女性血液DNA中低甲基化并且在胎儿DNA中高甲基化的DMR，已经表明，以精确预测存在于妊娠期母体血液样品中胎儿DNA的非整倍体性。在本发明专利技术的方法中，高甲基化DNA优选通过甲基化DNA免疫沉淀从低甲基化DNA中物理分离。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】无创产前诊断胎儿非整倍体性的方法和组合物
技术介绍
产前诊断目前一般使用传统细胞遗传学分析(例如核型)或者DNA分析(例如QF-PCR),其要求通过羊膜穿刺术,绒毛膜绒毛样检或者脊索穿刺(chordocentesis)获得胎儿遗传材料。尽管如此，这些是创伤性治疗程序，并且具有显著的胎儿死亡风险(绒毛膜绒毛样检和羊膜穿刺术为O. 5至1% ) (Hulten, Μ. A.等(2003)Reproduction 126 279-297)。有效产前诊断测试的必要性尤其重要，就唐氏综合症(也称为三染色体21综合症)来说，其是产生智力迟钝频率最高的形式(具有在世界范围所有出生婴儿中700分之一的发生率)。尽管如此，由于目前的产前测试的风险，产前诊断只提供给高风险的妊娠(所有妊娠中的6-8%)，其评价是根据母体血清筛选和胎儿和胎儿超声波检查方法。因此，迫切需要发展不会对胎儿造成危险的诊断方法，也通常被称为无创产前诊断。在怀孕期间的母体循环中发现了游离胎儿DNA (ffDNA) (Lo, Y. M.等(1997)Lancet^迎485-487)，其已经成为发展无创产前测试的重要替代途径。ffDNA已经被成功 用于确定胎儿性别和在母体血浆中的胎儿RhD状态(Lo，Y. Μ.等(1998) N. Engl. J. Med. 339 1734-1738 ；Bianchi,D. ff.等(2005)Obstet. Gynecol. 106 :841-844)。尽管如此，对存在于过量母体DNA中的限定量的ffDNA (3至6 % )进行直接分析，其对发展胎儿非整倍体性的无创性测试是巨大挑战。在所述领域的最新进展显示所述ffDNA的物理和分子特性可以用于将其从循环母体DNA中鉴别出来或者作为胎儿DNA富集的手段(Chan，K. C.等(2004)Clin. Chem. 50j88-92 ；Poon, L. L.等(2002) Clin. Chem.坚35-41)。例如，按大小进行分离的方法已经被用于血浆DNA，以富集胎儿DNA，因为胎儿DNA通常比循环中母体DNA的短(Chan，K. C.等(2004)，supra)。此外，根据母体血浆中ffDNA是来自胎盘起源的证据，母体周围(整体)血液和胎盘DNA之间的表观遗传差异已经被用于检测在来自胎儿的母体血浆中的低甲基化基因序歹Ij (maspin/SERPINB5) (Masuzaki，H.等(2004) J. Med. Genet. 41 :289-292 ；Fiori,E.等(2004) Hum. Reprod. 19 :723-724 ；Chim, S. S.等(2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA102 14753-14758)。后来，描述了少量的其它差异胎儿表观遗传分子标记，包括染色体3上的RASSF1A基因和染色体 21 上的标记(Chiu,R. W.等(2007) Am. T. Pathol. 170 :941-950 ；01d,R. W.等(2007) R印rod. Biomed. Online 15 :227-235 ；Chim, S. S.等(2008) Clin. Chem. M :500-511)。尽管这些研究已经证明在胎儿DNA(从绒毛膜绒毛样检获得的胎盘DNA)和母体外周血DNA之间的表观遗传差异，可以作为无创产前诊断潜在的胎儿分子标记，并且目前为止仅仅限定量的基因组区域已经被识别或检测出来。大量的研究集中于单基因启动子区域(Chim, S. S.等(2005) supra ；Chiu, R. W.等(2007, supra),然而其它的已经研究了在染色体 21 上的 CpG 岛(Old, R. W.等(2007) supra ；Chim, S. S.等(2008) supra)，尽管其仅仅覆盖一小部分的所述染色体(Fazzari, M. J.等(2004) Nat. Rev. Genet. 5 :446-455) 目前的方法发展了使用ffDNA进行无创产前诊断，常遭受大量的限制。被研究的一种方法涉及利用甲基化敏感限制酶来消除低甲基化母体DNA从而允许ffDNA的直接聚合酶链反应(PCR)分析(Old，R.W.等(2007)，supra)。尽管如此，差异甲基化DNA的必要区域(含有甲基化敏感限制酶识别的限制性微点)限制了适合测试的区域的数量。被研究的另一种方法涉及利用亚硫酸氢钠转换以允许区别在母体和胎儿DNA之间的差异甲基化。在这种方法中，亚硫酸氢钠转换之后进行甲基化特异性PCR或者甲基化敏感单核苷酸引物延伸和 / 或亚硫酸氢钠测序(Chim, S. S.等(2005) supra ；Chiu, R. W.等(2007) supra ；Chim,S.S.等(2008)SUpra)。这种方法，尽管有两个主要问题。首先，亚硫酸氢盐转换之后的甲基化状态的精确分析取决于非甲基化胞嘧啶到脲嘧啶的完全转换(这个条件很少能达到)。其次，在从亚硫酸氢盐处理后获得的DNA的降解(描述参见于Grunau，C.等(2001)Nucl.Acids Res. 29 E65-5)变得复杂，甚至进一步的极低量的胎儿DNA的测试和定量。另一种最近的方法已经直接测序细胞游离DNA(cell-free DNA)(来自于怀孕妇女的血衆中)，使用高通量鸟枪测序技术(Fan, H. C.等(2008) Proc. Natl. Acas. Sci. USA105 16266-71 ；Chiu, R. W.等(2008) Proc. Natl. Acad. Sci USA. 105 :20458-63)。但是，这种方法要求技术，并且这种方法的成本高使得它的应用对多数实验室诊断来说相当困难。·因此，需要其它的途径和方法，作为无创产前诊断胎儿非整倍体性，以减少胎儿死亡的风险并允许筛选所有的妊娠，而不仅限于高风险妊娠。专利技术概述本专利技术提供一种新的途径，其根据检测ffDNA进行无创产前诊断。已经识别在每种被检测染色体上(染色体13、18、21、X和Y)的大量(多于2000)差异甲基化区域(DMR)(其在母体外周血和胎儿DNA(胎盘DNA)之间被差异甲基化)，通过利用具有高分辨率tiling寡核苷酸阵列(tilingoligonucleotide array)分析的系统稱合甲基化DNA免疫沉淀(MeDiP)，其能够以高通量的途径全染色体范围地识别DNA甲基化模式。进一步的，这些DMR的子集的代表性实施例(其在胎儿DNA中高甲基化，在母体外周血中低甲基化)已经被用来精确预测三染色体21，这种预测方法是基于从在母体血液样品中的低甲基化DNA物理分离高甲基化DNA (其通常在胎龄的早期妊娠阶段，并且没有对高甲基化DNA或低甲基化DNA进行化学改变或者酶消化)，然后测定在所述高甲基化DNA样品中的多个DMR的水平。因此，已经证明了本公开的DMR和诊断胎儿非整倍体性的方法的有效性。因此，在一个方面中，本专利技术涉及使用母体血液样品进行产前诊断胎儿非整倍体性的方法，所述方法包括 a)在母体血液样品中，从低甲基化DNA中物理分离高甲基化DNA，而没有使所述低甲基化DNA或高甲基化DNA进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·C·帕特萨里斯，E·A·帕帕乔治乌，
申请(专利权)人：NIPD遗传学有限公司，
类型：
国别省市：