一种从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法，将手术或活检标本用中性福尔马林固定，脱水，石蜡包埋，切多张白片，选择其中一张白片行HE染色，在光学显微镜下观察HE染色片的肿瘤组织细胞分布，并标记出靶细胞的分布区域；剩余白片经烤片后再进行二甲苯脱蜡，然后对照标记好的HE染色片将白片上富含靶细胞的组织刮下富集靶细胞，最后对富集的靶细胞进行核酸提取。该方法能够提高靶细胞的核酸浓度，达到40%至60%以上，从而提高分子病理检测阳性率，减少假阴性率，不需要昂贵的仪器设备和专门复杂的技术，几乎无明显的时间消耗，适宜在所有检验病理科和生物实验室推广应用，对临床诊断治疗提供更为准确的分子诊断。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及核酸的提取方法，具体涉及。
技术介绍
现有的提取石蜡组织切片核酸的方法，先采用石蜡切片机对石蜡组织块切片(又称切白片或切卷片)中包含的菲薄组织细胞脱蜡，酒精溶解至水，然后进行蛋白酶消化，冷冻离心纯化后用酚氯法或试剂盒提取核酸。由于切片组织中共同生长不同良恶性质的组织细胞以不同成份比例存在并各有差异，导致所提取的细胞总核酸成份是上述不同性质组织细胞的混合体，影响实现目标数据的真实性。为达到实验观察准确反应目标组织细胞核酸的目的，从而使实验结果真实反应目标核酸数据的科学性、准确性、重复性，对目标核酸实验结果应用到医学基因检测应用，在提取核酸前分离富集目标核酸，然后提取，可以真实反应白片中全部细胞中的靶细胞核酸质量，具有重要的临床评估意义，产生关键临床诊疗应用价值。如，肺癌白片中由不同比例的肺组织和癌组织共同存在，肺组织细胞核中只具有没有EGFR基因突变的野生型细胞，亚洲人癌组织中约60%以上是同样EGFE野生型细胞。如果不在提取总核酸前去除肺组织野生型细胞，他们与癌组织中60%以上的野生型细胞混在一起提取核酸，将大大增加EGFR野生型核酸数量和比例，导致突变型肺癌细胞含量可能下降到25%比例以下，这时有些基因检测方法和技术很难检测出该白片组织中有EGFR突变的肺癌细胞，导致临床医师依据EGFR基因突变假阴性结果制定不采用靶向治疗方案，患者失去对存在少量突变型肺癌细胞治疗而获益的机会。反之，如果先将正常肺组织EGFR野生型细胞剔除只剩下肺癌组织，其中EGFR突变型癌细胞所含核酸浓度比例上升易于检出。目前国内少数提取石蜡组织核酸的技术，基本没有应用切白片并经HE染色对照富集并保护脱蜡切片后核酸再提取，而是未经HE染色病理观察标本靶细胞区域，用囫囵机械破碎或沸水煮化石蜡组织或卷片后，在离心管内直接脱蜡的方法。例如常明等，肾穿刺活检石蜡组织切片DNA的提取和PCR扩增，中华肾脏病杂志，2007，23 (11) =740-743 ；王丽江等，石蜡组织提取DNA4种方法的比较，诊断病理学杂志，2004，11 (I) :57_58。
技术实现思路
专利技术目的针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供，该方法以HE染色片为模板，将白片上的靶细胞经光镜下富集并提取靶细胞核酸。技术方案为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下一种从 标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法，将手术或活检标本用中性福尔马林固定，脱水，石蜡包埋，切5-15张白片，选择其中一张白片行HE染色，在光学显微镜下观察HE染色片的肿瘤组织细胞分布，并标记出靶细胞的分布区域。白片烤片后二甲苯脱蜡，然后对照标记好的HE染色片将白片上富含靶细胞的组织刮下以富集靶细胞，最后对富集的靶细胞进行核酸提取即可。上述从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法，具体步骤包括(I)将手术或活检标本用中性福尔马林固定。巨大器官组织要切开固定8 24h，小块组织的固定时间约4h左右。(2)组织脱水。由低浓度逐级上行至高浓度乙醇脱水(一般70 100%的浓度)，逐步置换组织内的水份。(3)浸蜡。用于浸蜡的石蜡最好是熔点稍低(56 58°C)。根据脱水机配有的蜡缸数量，设定标准浸蜡程序，浸蜡采用二级至四级。不同大小和厚薄的组织浸蜡时间有所不同，一般为I 3h。(4)石蜡包埋。组织经浸蜡后即进行包埋。包埋时把组织最大最平切面或所需的病灶切面向下，对皮肤、肠管和囊壁等层次清楚的组织其切面应包含有各层组织。(5)切片。切片的厚度应为4-10 μ m。(6)烤片。切出的蜡片标号后放入约60 95°C的烤箱内或65°C以上恒温热板上烤烘15 60分钟，使蜡片牢固地粘附在玻片上。烤烘切片的温度一般比包埋石蜡的熔点闻5 C左右ο(7)切片脱蜡脱蜡一般用分析纯或三级脱蜡剂如二甲苯，时间为O. 5_12h。如果脱蜡剂使用多次或室温较低，或组织致密均需延长脱蜡时间。(8)选择一张切片行病理标准程序上的HE染色。并在常规光学显微镜下观察，用标记笔画出靶细胞分布范围,耗时在2min之内。(9)其他白片用乙醇由高浓度逐级下行至低浓度乙醇清洗二甲苯(一般70% 100%的浓度)。接着将片子置于清水中清洗掉乙醇。(10)对照标记好的HE染色片，将剩余白片上富含靶细胞的组织用干净的刀片刮下以富集靶细胞，使靶细胞成份比例达到白片总组织细胞成份40 60%以上，并立即转到离心管内。(11)按说明书提取靶细胞核酸即可。操作全过程中，禁止细胞片裸露在空气中。所述的HE染色片为从手术病理石蜡包埋组织、穿刺组织、胃肠镜活检以及细胞涂片中通过正常病理步骤切片、染色得到的HE染色片。所述的核酸包括DNA、RNA和miRNA。步骤(11)中，采用常规方法或采用常规试剂盒进行核酸提取。近年来，随着核酸提取技术方法及试剂盒质量的进步，对石蜡残微核酸的提取纯化有了极大地进步，但还不能满足靶细胞石蜡白片提取靶细胞目标核酸的需求。本专利技术通过创造，根据HE染色片的组织分布情况富集石蜡白片的靶细胞，然后再从富集的靶细胞中提取高浓度肿瘤细胞成份核酸，能够获得临床真正需要的，有针对性突变的核酸等，可以极大地减少或消除基因检测假阴性实验数据，为临床应用提供准确数据。有益效果 与现有技术相比，本专利技术的从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法，先对手术标本的常规HE染色片进行靶细胞范围标记，然后再根据标记范围刮取石蜡白片上的靶细胞，对富集的靶细胞进行核酸的提取，能够提高靶细胞的核酸浓度，达到40%至60%以上，从而提高分子病理检测阳性率，减少假阴性率，不需要昂贵的仪器设备和专门复杂的技术，几乎无明显的时间消耗，适宜在所有检验病理科和生物实验室推广应用，对临床诊断治疗提供更为准确的分子诊断，能够产生很好的社会效应。附图说明图I是未作镜检富集选择靶区大肠癌组织细胞提取核酸进行敏感度参比测序图；图2是作镜检富集选择靶区大肠癌组织细胞提取核酸进行敏感度参比测序图。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术作更进一步的说明。以下实施例所使用的材料为从各种手术获取的细胞学和病理石蜡包埋组织(FFPE)、穿刺组织、胃肠镜活检标本，通过正常病理步骤切片、染色得到的HE染色片。各材料的正常病理步骤切片、染色可以为(I)手术石蜡组织切片染色各种组织标本经大体观察，取材，记录登记后，针对病理部位切取的小于2cm边长及2mm厚组织块，进入甲醛类固定，顺序酒精脱水和二甲苯一石蜡浸蜡流程，按包埋成石蜡组织块，用切片机切成4-10um厚白片，烤化lh，脱蜡至水后进入HE染色流程(苏木素染色 ，水洗后盐酸分化，热水和自来水流水漂洗，酒精二甲苯顺序脱水)，中性树胶封片，镜检病理诊断后，HE切片归档保存及二次会诊分子病理检测应用。(2)穿刺或内镜活检染色各种组织标本经大体观察，取材，记录登记后，进入甲醛类固定，顺序脱水和二甲苯一石蜡浸蜡流程，按记录单包埋成石蜡组织块，用切片机切成4-10um厚白片，烤化lh，脱蜡至水后进入HE染色流程(苏木素染色，水洗后盐酸分化，热水和自来水流水漂洗，酒精二甲苯顺序脱水)，中性树胶封片，镜检病理诊断，HE切片归档保存或二次会诊分子病理检测应用。实施例I白片的脱蜡将白片视标本大小选择数张(2-15张)浸入二甲苯浸泡8 12h，充分溶解石蜡；更换本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法，其特征在于：将手术或活检标本用中性福尔马林固定，脱水，石蜡包埋，切多张白片，选择其中一张白片行HE染色，在光学显微镜下观察HE染色片的肿瘤组织细胞分布，并标记出靶细胞的分布区域；剩余白片经烤片后再进行二甲苯脱蜡，然后对照标记好的HE染色片将白片上富含靶细胞的组织刮下富集靶细胞，最后对富集的靶细胞进行核酸提取，即可。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赖仁胜，吴晓斌，谢玲，陈劼，余波，赵明，孙军华，张树鹏，
申请(专利权)人：南京紫霄科技有限公司，赖仁胜，吴晓斌，
类型：发明
国别省市：