本发明专利技术公开了一种复合污染河流底泥微生物总DNA提取的前处理方法。它是将复合污染河流底泥样品置于去腐试剂中，65℃振荡混匀，然后离心去上清收集沉淀底泥；再加入去腐试剂中，振荡混匀，离心去上清收集沉淀底泥，如此重复洗涤，直至上清为无色，即得到前处理后的样品；所述的去腐试剂为含有0.1M?EDTA，pH8.0?0.1M?Tris-HCl，1.5M?NaCl，0.1M?NaH2PO4和0.1M?Na2HPO4，余量为水。利用常规方法提取前处理后的复合污染河流底泥中微生物总DNA，能够获得完整的、高质量的微生物总DNA，可较好地满足后续微生物群落结构及其生态功能研究的相关要求，有利于后续分子操作，为污染河流监测和修复的研究提供技术保障。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种复合污染河流底泥微生物总DNA提取的前处理方法。
技术介绍
:河流沉积物中的微生物可对污染物进行有效地分解和转化，并快速、灵敏地反映河流的污染状况，在河流生态修复和健康状况监测方面发挥着重要的作用。现已知所能培养得到的微生物只占总微生物数量的不到1%。随着现代分子生物学、基因组学、生物信息学的快速发展，研究者们可以利用免培养的手段开展微生物的相关研究，为了解河流健康状况和发展河流污染治理的微生物技术提供科学依据和理论指导。其中，完整的、高质量的、有利于后续分子操作的微生物总DNA的获取，是开展相关工作的重要保障。然而，由于污染河流沉积物成分复杂，其中的污染物成份不仅能抑制提取过程中所使用试剂(SDS、溶菌酶、蛋白酶K)的作用，影响DNA的抽提效果，而且有些与DNA沉降性质相似的腐殖酸等污染物可与DNA共同沉淀析出，导致其质量的下降，从而影响其后续分子水平的操作，甚至实验数据的可靠性。如何在DNA提取过程中有效地去除河流沉积物中的污染物，是保证河流沉积物微生物总DNA质量的关键。 从环境样品中直接分离DNA的过程中，去除样品中的抑制物的策略大体上有四种:第一、在细胞裂解前将抑制物与DNA分离。如用PBS、EDTA、Tween-20等洗涤样品，或加入CaCO3等絮凝剂使抑制物絮凝分离。第二、细胞裂解过程加入试剂使抑制物和DNA进入不同的相，使两者分离。如含CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)、Triton X_100、PVPP(交联聚乙烯吡咯烷酮)、CaCl2等的裂解缓冲液提取DNA。第三、将粗提的DNA通过梯度离心、凝胶电泳、Sephadex G-200柱层析等方法分离抑制物。第四、对DNA进行操作时，对样品进行稀释或者加入BSA(牛血清白蛋白)等试剂降低抑制物的作用。四种策略中，第一种策略是在首步将DNA与抑制物分离，其优势是显而易见的，可以在细胞裂解之前将抑制物污染风险减到最小，提闻DNA的质量
技术实现思路
:本专利技术的目的是提供一种快速、简易、低成本的复合污染河流底泥微生物总DNA提取的前处理方法，从而为能够获得完整的、高质量的、有利于后续分子操作的微生物总DNA,为污染河流监测和修复的研究提供技术保障。本专利技术的复合污染河流底泥微生物总DNA提取的前处理方法，其特征在于，将复合污染河流底泥样品置于去腐试剂中，65°C振荡混匀，然后离心去上清收集沉淀底泥；再加入去腐试剂中，振荡混匀，离心去上清收集沉淀底泥，如此重复洗涤，直至上清为无色，即得到前处理后的样品；所述的去腐试剂为含有0.1M EDTA, pH8.00.1M Tris-HCl, 1.5M NaCl,0.1MNaH2PO4 和 0.1M Na2HPO4，余量为水。前处理后的样品再按照常规的提取总DNA的方法提取微生物总DNA就行。所述的65°C振荡混匀，其振荡时间优选为15min。本专利技术在复合污染河流底泥中的微生物细胞裂解前，用去腐试剂洗涤底泥，去腐试剂能有效去除底泥中的腐殖质、腐殖酸、重金属和有机物等抑制物，合适的温度一方面可以增加试剂作用强度与无序自由扩散动力，另一方面加快某些在较低温度下不能溶解的腐殖质的溶解和去除，从而使利用本专利技术的前处理方法处理后的复合污染河流底泥能够避免重金属、腐殖酸和腐殖质等杂质的影响，利用常规的DNA提取方法提取前处理后的复合污染河流底泥中微生物总DNA，能够获得完整的、高质量的微生物总DNA，可较好地满足后续微生物群落结构及其生态功能研究的相关要求，有利于后续分子操作，为污染河流监测和修复的研究提供技术保障，为了解河流健康状况和发展河流污染治理的微生物技术提供科学依据和理论指导。附图说明:图1是不同去腐试剂浸泡洗涤底泥情况，其中a为浸泡底泥离心后的情况，b为洗涤3次后底泥离心后的情况；图2是不同浸泡温度处理后的底泥的粗DNA的凝胶电泳图；图3是不同浸泡温度处理后的底泥的粗DNA的酶切图谱；图4是不同浸泡温度处理后 的底泥的粗DNA16S rDNA V3区PCR产物凝胶电泳图。具体实施方式:以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的控制。实施例1:去腐试剂的选择将来自广东省佛山市容桂镇河涌中复合污染的底泥样品分成9份，每份0.25g(湿重)，分别加入 3ml 去腐试剂 SO:含 0.1M EDTA，0.1M Tris-HCl (ρΗ8.0), 1.5Μ NaCl,0.1M NaH2PO4 和 0.1M Na2HPO4,余量为水；去腐试剂 SI:0.1M EDTA，0.1M Tris-HCl(pH8.0), 1.5M NaCl,0.1M NaH2PO4 和 0.1M Na2HPO4,1%CTAB，余量为水；去腐试剂 S2:0.1MEDTA，0.1MTris-HCl (ρΗ8.0)，1.5Μ NaCl,0.1M NaH2PO4 和 0.1M Na2HPO4, 0.05%TritonX-100, 1%CTAB，余量为水。每种处理3个平行。25° C水浴震荡IOhrs后，12000rpm,25° C，离心5min，去上清，再分别加相应去腐试剂3ml洗涤2次至上清为无色，去上清后再加入相应去腐试剂2ml重悬，得到前处理后的复合污染河流底泥样品；不同去腐试剂浸泡洗涤的前处理后的复合污染河流底泥样品情况如图1所示。前处理后的复合污染河流底泥样品按照传统的微生物总DNA提取步骤进行。具体如下:前处理后的复合污染河流底泥样品反复冻融-80° ClOmin, 65° C5min3次后加入25 μ I溶菌酶(100mg/ml )，37° C水浴震荡30min后加入10μ I蛋白酶K (20mg/ml), 37° C震荡30min ;然后加入220 μ I预热的20%十二烧基横酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS), 65° C 水浴 2hrs,每隔 15_30min 轻轻颠倒；12000rpm,25° C，IOmin收集上清液,再加入等体积氯仿:异戍醇(24:1),颠倒混勻后12000rpm，25° C，IOmin再次收集上清液，加入0.6倍体积的异丙醇，沉淀DNAlhrs ;再用12000rpm, 25° C，20min离心收集DNA沉淀。得到的DNA沉淀用70%的乙醇洗2次，于室温干燥后加入50 μ I去离子水溶解，由此得到各前处理后的复合污染河流底泥样品的粗DNA。采用NanoDrop测定粗DNA产率及质量,具体结果如见表I所示。表1:不同试剂浸泡洗漆底泥后粗DNA质量分析表本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种复合污染河流底泥微生物总DNA提取的前处理方法，其特征在于，将复合污染河流底泥样品置于去腐试剂中，65℃振荡混匀，然后离心去上清收集沉淀底泥；再加入去腐试剂中，振荡混匀，离心去上清收集沉淀底泥，如此重复洗涤，直至上清为无色，即得到前处理后的样品；所述的去腐试剂为含有0.1M?EDTA，pH8.00.1M?Tris?HCl，1.5M?NaCl，0.1M?NaH2PO4和0.1M?Na2HPO4，余量为水。
【技术特征摘要】
1.一种复合污染河流底泥微生物总DNA提取的前处理方法，其特征在于，将复合污染河流底泥样品置于去腐试剂中，65°C振荡混匀，然后离心去上清收集沉淀底泥；再加入去腐试剂中，振荡混匀，离心去上清收集沉淀底泥，如此重复洗涤，直至上清为无色，即得到前处理后的样品； 所...
【专利技术属性】
技术研发人员：许玫英，方云，陈杏娟，孙国萍，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。