本发明专利技术提供了一种分离叶绿体DNA的方法,包括下列步骤：以新鲜的叶片为材料,匀浆后,经过滤、滤液离心获得叶绿体；采用DNaseI、RNaseA和蛋白酶K酶解去除叶绿体外吸附的核DNA获得纯化的叶绿体；裂解叶绿体，纯化叶绿体DNA。与现有技术相比，提取时间节省了近一半，且制备分离的叶绿体DNA纯度较高,以分离的cpDNA为模板完全能够满足PCR和目标基因序列的克隆等常规分子生物学操作的需要，并且分离的cpDNA能够达到高通量测序中对实验样品的要求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种分离叶绿体DNA的方法。
技术介绍
茶树(Camellia sinensis (L.))隶属于山茶科山茶属，为多年生常绿木本植物，是我国重要的经济作物之一。因其含有儿茶素类、茶多酚和咖啡碱等多种药用和保健成份，广泛地受到人们的关注。叶绿体是植物光合作用的器官，同时也是细胞内具有自主遗传信息的细胞器。伴随着生物技术的深入发展，人们发现叶绿体因基因组小，编码区及非编码区进化速率的差异而越来越多地被用于各类分类阶元的系统发育研究，叶绿体基因组结构和序列的信息在揭示物种起源、进化演变及其不同物种之间的亲缘关系等方面具有重要价值。而且，利用叶绿体基因工程来改良作物的产量及重要化合物的含量具有重要意义。提取较高纯度的叶绿体DNA(cpDNA)是进行对叶绿体基因组测序及序列和结构分析的基础。目前最常用的叶绿体基因组提取纯化方法主要是在以下两种方法的基础上发展建立起来的:高盐缓冲方法和蔗糖或Percoll密度梯度法。在早期，赵衍(赵衍等，1986 ；1991)将调节低的pH来改变细胞器表面带电状况与蔗糖梯度离心相结合提取水稻cpDNA，龚小松(龚小松等，1991)又将低pH法和高盐缓冲结合起来，用于高粱的cpDNA的纯化，均得到很好的效果，而且操作也快速简便、省去密度梯度离心昂贵、耗时的步骤，对仪器的要求不高，成本较低。然而，茶树叶片具有很多丰富而特有的次生代谢物，在分离纯化叶绿体DNA过程中这些物质很容易被氧化，导致茶树叶绿体基因组DNA的提取因为其叶片的特殊结构和成分而困难重重，且仅采用高盐低PH方法仍有核基因组的污染，因此需要根据茶树叶片的特殊性质 ，建立一套适用于山茶属乃至所有高等植物的叶绿体DNA提取方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种分离叶绿体DNA的新方法。本专利技术的方法可以获得纯度很高且完整的叶绿体DNA。本专利技术提供的分离叶绿体DNA的方法，包括叶绿体的提取、叶绿体外核DNA的去除和叶绿体DNA的提取三个步骤。具体的，包括下列步骤:(I)以新鲜的叶片为材料，匀浆后，经过滤、滤液离心获得叶绿体；(2)采用DNasel、RnaseA和蛋白酶K酶解去除叶绿体外吸附的核DNA ；(3)裂解叶绿体，纯化叶绿体DNA，最终得到了纯度非常高的完整的叶绿体DNA。更为具体的，步骤(I)中:所述新鲜叶片可为绿叶植物的叶片。优选茶树(Camellia sinensis (L.))的新鲜叶片。所述茶树可选任一品种的茶树。新鲜叶片可直接用于分离叶绿体；或者也可将新鲜叶片于-80°C冰箱保存备用。分离叶绿体前无需将叶片置于4°C冰箱中暗处理。匀浆可采用普通家用榨汁机将叶片充分匀浆。较佳的，匀浆前，榨汁机经预冷处理。匀浆时，将叶片与预冷的缓冲液A混合匀浆。所述缓冲液A的pH为3.6-3.8，每IOOOml包括下列组分:EDTA-Na26-9gTris4-8gNaCl60-100g抗坏血酸30-50g水余量所述缓冲液A的制备方法如下:按比例称取EDTA-Na2, Tris, NaCl，抗坏血酸，力口水混匀，调pH至3.6-3.8，再定容。较佳的，缓冲液A预冷为2-8°C，匀浆时间为0.5-lmin。较佳的，新鲜叶片与缓冲液A的重量体积比为:30_50g:400ml。较佳的，匀浆液经两层纱布过滤，过滤完毕后挤出残留的液体；再用四层纱布过滤，过滤完毕不要挤压，得到滤液。滤液离心可采用常规速度。较佳的，滤液离心包括下列步骤:I)滤液分装后，100_300g离心3-lOmin，收集上清；2)将步骤I)获得的上清液，1 500_2500g离心10_15min，弃上清；用预冷的缓冲液B重悬沉淀并再次离心弃上清，多次重复此步骤；获得的沉淀即为叶绿体。所述离心的温度优选4°C。所述缓冲液B的pH为1.0-9.0,每IOOOml包括下列组分:EDTA-Na26-9gTris4-8 gNaCl60—IOOgBSA0.5-3gβ-巯基乙醇1.5-3ml水余量所述缓冲液B (分离缓冲液)的配制方法如下:按比例将EDTA-Na2, Tris, NaCl加水混匀，调pH至8.0，再加入BSA和β -巯基乙醇，加水定容。较佳的，新鲜叶片与缓冲液B的重量体积比为:30-50g:200-300ml。本专利技术所述分离叶绿体DNA的方法中，所述步骤(2)具体包括下列步骤:a.向步骤(I)获得的叶绿体中加入预冷的缓冲液C，2_8°C下1500_2500g离心10-15min,弃上清。b.用缓冲液C重悬步骤a的沉淀，加入DNaseI和RNaseA，37°C反应5_10分钟，然后加入蛋白酶K37°C反应5-10分钟，再加入EDTA-Na2水溶液终止酶解；c.将步骤b的酶解液用预冷的缓冲液D冲洗，2-8°C、3000-4000g离心15_20min弃上清，获得纯化的叶绿体。所述缓冲液C的pH为7.0-9.0,每500ml包括下列组分:蔗糖6-9g Tris2-4gBSA0.2-1, Sg水余量所述缓冲液C(清洗缓冲液)的配制方法如下:按配比称取蔗糖，Tris，加双蒸水后，调pH，再加入BSA，并定容。较佳的，新鲜叶片与步骤a所用缓冲液C的重量体积比为:30-50g:1O-1OOml较佳的，新鲜叶片与DNase1、RnaseA和蛋白酶K的比例为:30_50g新鲜叶片:5_15UDNase1:1OO-3OOugRNaseA:1OO-3OOug 蛋白酶 K。较佳的，加入EDTA-Na2水溶液使EDTA-Na2终浓度达到0.1-1.0moI/L终止酶解。所述缓冲液D的pH为7.0-9.0,每IOOOml包括下列组分: EDTA-Na215-30 g Tris4-8gNaClh0-l00g NaFl_3g水余_￥:所述缓冲液D (DNaseI清洗缓冲液)的配制方法如下:按配比称取EDTA-Na2, NaCl，Tris, NaF,加双蒸水，调pH至8.0,再加水定容。较佳的，新鲜叶片与缓冲液D的重量体积比例为:30_50g:50_100ml。获得纯化的叶绿体需马上镜检观察，立即用于后续DNA纯化步骤或置沉淀于-20°C长期保存。纯化获得叶绿体后，可采用常规方法抽提DNA。进一步改进的,从纯化的叶绿体中抽提DNA的具体包括下列步骤:A.向纯化的叶绿体沉淀中加入裂解液，65 V裂解30_45min，加入RNaseA，室温_37°C静置5-10分钟获得消化液。B.向步骤A得到的消化液中加入酚/氯仿/异戊醇混合液，抽提I次；取上清，加入氯仿/异戊醇混合液抽提I次；C.取上清液加入预冷的异丙醇和1/10体积的5-10mol/L乙酸盐，-20 °C放置10-30min, 10000-14000rpm离心10_20min，收集沉淀，用70_95v%乙醇冲洗并晾干；D.加入TE缓冲液溶解。较佳的，步骤A所用裂解液为Plant DNAzol植物基因组DNA快速提取试剂(杭州莱枫生物科技有限公司)。在裂解叶绿体时，采用该裂解液仅需约30min。裂解时，如采用室温以上温度，可采用水浴。步骤B中，所述酚/氯仿/异戊醇混合液中酚:氯仿:异戊醇的体积比为25: 24:1 ;氯仿/异戊醇混合液中氯仿:异戊醇的体积比为24: I。步骤C中，所述乙酸盐为乙酸钾、乙酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离叶绿体DNA的方法,包括下列步骤：（1）以新鲜的叶片为材料,匀浆后,经过滤、滤液离心获得叶绿体；（2）采用DNaseI、RnaseA和蛋白酶K酶解去除叶绿体外吸附的核DNA获得纯化的叶绿体；（3）裂解叶绿体，纯化叶绿体DNA。
【技术特征摘要】
1.一种分离叶绿体DNA的方法，包括下列步骤: (1)以新鲜的叶片为材料，匀浆后，经过滤、滤液离心获得叶绿体； (2)采用DNase1、RnaseA和蛋白酶K酶解去除叶绿体外吸附的核DNA获得纯化的叶绿体； (3)裂解叶绿体，纯化叶绿体DNA。2.如权利要求1分离叶绿体DNA的方法，其特征在于，所述更为具体的，步骤(I)中，匀浆时，将叶片与预冷的缓冲液A混合匀浆，所述缓冲液A的pH为3.6-3.8，每IOOOml包括下列组分:EDTA-Na2Tris4_8gNaCI60-1OOg抗坏血酸30-50g水余量。3.如权利要求2分离叶绿体DNA的方法，其特征在于，所述新鲜叶片与所述缓冲液A的重量体积比为:30-50g:400ml。4.如权利要求1分离叶绿体DNA的方法，其特征在于，步骤(I)中，滤液离心包括下列步骤: O滤液分装后，100-300g离心3-10min,收集上清； 2)将步骤I)获得的上清液，1500-2500g离心10_15min，弃上清；用预冷的缓冲液B重悬沉淀并再次离心弃上清，多次重复此步骤；获得的沉淀即为叶绿体； 所述缓冲液B的pH为7.0-9.0,每IOOOml包括下列组分:EDTA-Na26_9gTris4-8 gNaCl60-1OOg BSA0.5-3gβ-巯基乙醇1.5-3ml水余量。5.如权利要求4所述分离叶绿体DNA的方法，其特征在于，所述新鲜叶片与所述缓冲液B的重量体积比为:30-50g:200-300ml。6.如权利要求1所述分离叶绿体DNA的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括下列步骤: a.向步骤(I)获得的叶绿体中加入预冷的缓冲液C，2-8V下1500-2500g离心10-15min,弃上清； b.用缓冲液C重悬步骤a的沉淀，加入DNaseI和RNaseA, 37°C反应5-10分钟，然后加入蛋白酶K37°C反应5-10分钟，再加入EDTA-Na2水溶液终止酶解； c.将步骤b的酶解液用预冷的缓冲液D冲洗，2-8°C、3000-4000g离心15_20min弃上清，获得纯化的叶绿体； 所述缓冲液C的pH为7.0-9.0,每500ml包括下列组分:萠糖6-9g Tris2_4g BSAO, 2-1.Sg水余量 ； 所述缓冲液D的pH为7.0-9.0,每IOOOml包括下列组...
【专利技术属性】
技术研发人员：施菲，李威，
申请(专利权)人：生工生物工程上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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