一种获得已知序列侧翼未知序列的方法技术

本发明专利技术公开了一种获得已知序列侧翼未知序列的方法，包括如下步骤：1）根据已知的序列设计两条特异性引物，标记为SP1和SP2，SP2带限制性内切酶识别位点，在SP2到边界序列之间设计一对反向PCR引物F1和D1；2）以基因组DNA为模板以任意一个兼并引物和特异的SP1引物，扩增得到PCR产物1；3）以所述PCR产物1为模板，使用特异的SP2引物和步骤2）中同种但加入限制性内切酶识别位点的兼并引物扩增得到PCR产物2；4）将PCR产物2酶切后加入T4连接酶环化，以此为模板，使用F1和D1引物扩增得到PCR产物3，从而获得所述侧翼序列。本发明专利技术提供方法具有以下优点：操作简易、成本低廉、成功率高、耗时短等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因组未知序列扩增领域，具体涉及一种获得已知序列侧翼未知序列 的方法。
技术介绍
侧翼扩增是探明基因序列的关键技术。传统的扩增未知序列的方法可以分成两 种：一种是将序列环化，设计反向引物扩增未知序列，用来酶切的酶具有物种特异性，有效 扩增的概率低，影响成功率；另一种是使用特异性引物和兼并引物扩增未知序列，该种方法 非特异性扩增多，影响成功率。本专利技术综合两种方法，先引入兼并引物扩增侧翼序列，在通 过粘性末端环化产物后扩增，减少非特异性扩增的同时提高了扩增效率，增加成功率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，利用该方法可以 获得未知的侧翼序列，操作简单，成本低廉，成功率高，耗时短。 为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案： 本专利技术的方法具体如下： ，包括如下步骤： ⑴选择已知序列，设计两条方向一致的特异性引物，从远离边界序列到靠近边界序列 的顺序依次标记为SPl和SP2, SP2带限制性内切酶识别位点，在SP2到边界序列之间再设 计一对反向PCR引物Fl和Dl ; (2) 以基因组DNA为模板，以6种兼并引物AD分别和所述SPl进行第一轮PCR扩增，得 到有扩增条带的PCR产物1 ; (3) 以所述的有扩增条带的PCR产物1为模板，使用特异的SP2引物和步骤（2)中同种 但加入限制性内切酶识别位点的相对应兼并引物AD'扩增得到PCR产物2 ; (4) 将PCR产物2酶切后加入T4连接酶环化，以此为模板，使用Fl和Dl为引物，扩增 得到PCR产物3,从所述PCR产物3中获得侧翼序列。 所述兼并引物AD及加入限制性内切酶识别位点的兼并引物AD'为如下： ADl :NTCGASTWTSGWGTT、AD' I :NTCGASTWTSGWGTTCCCGGG ; AD2 ：NGTCGASWGANAWGAA^ AD? 2 ：NGTCGASffGANAffGAACCCGGG ； AD3 ：NGTASASWGTNAWCAA^ AD? 3 ：NGTASASffGTNAffCAACCCGGG ； AD4 :STTGNTASTNCTNTGC、AD' 4 :STTGNTASTNCTNTGCCCCGGG ; AD5 ：AGffGNAGffANCAffAGG^ AD? 5 ：AGffGNAGffANCAffAGGCCCGGG ； AD6 :TGWGNAGWANCASAGA、 AD' 6 :TGWGNAGWANCASAGACCCGGG。 本专利技术优点体在于： 该方法有效的减少了引入兼并引物带来的非特异性扩增，操作简易、成本低廉、成功率 高、耗时短。【附图说明】 图1为的流程图其中a :在已知序列上设 计两条同向特异性引物SP1、SP2, SP2带限制性内切酶识别位点，在SPl和边界序列之间设 计一对反向引物Fl、Dl。b :SP1和AD为引物，基因组DNA为模板扩增。c :使用SP2和AD' 为引物，步骤b产物为模板扩增。d:步骤c得到的扩增产物。e:使用限制性内切酶酶切步 骤c得到的产物。f:使用连接酶环化步骤e中的产物，并以此为模板，使用FUDl为引物扩 增。g:得到的已知序列侧翼未知序列片段。 图2为引物设计图示，在已知序列上设计两条同向特异性引物SP1、SP2, SP2带限 制性内切酶识别位点，在SPl和边界序列之间设计一对反向引物Fl、D1。 图3为不对称引物第一次、第二次扩增电泳图，1是不对称引物第一次扩增产物电 泳条带，2是不对称引物第二次扩增产物电泳条带。 图4为酶切产物检测及以环化产物为模板PCR扩增未知序列产物电泳图，1是酶切 产物检测电泳条带，2是以环化产物为模板PCR扩增未知序列产物电泳图。【具体实施方式】 实施例1 UDNA提取和纯化： 可采用各种通用的DNA提取方法和纯化方法，提取得到纯化的基因组总DNA。 2、引物设计： 选择通过同源扩增得到的金线莲PAL基因中间片段的序列，设计两条方 向一致的特异性引物，从远离边界序列到靠近边界序列的顺序依次标记为SPl 5' -TGGTGTCACTACTGGATTTGG-3' 和 SP2 5' -CCCGGGGCATCCGATTCGAAATCCT-3'，SP2 带有限 制性内切酶识别位点5' -CCCGGG-3'，在SP2到边界序列之间再设计一对反向PCR引物Fl : 5' -CAAGATCGCCGGAGGCGGTG-3' 和 Dl :5' -CTTACATTGCGGGTGTCTTAACC-3'，如图 2。 3、未知序列扩增： A、不对称引物第一次扩增： 以基因组DNA为模板，以6种不同的兼并引物AD分别和所述SPl进行第一轮PCR扩增， 扩增体系为： TaqPlusPCR Master Mix 20ul， DNA 模板 2ul， 2* 引物（AD 和 SPl) 2ul， ddH20 16ul ； 扩增程序为： 94°C，30min ; 94Γ，3〇8,68Γ，Imin ;72Γ，2· 5min (5 个循环）； 94〇C, 30s ；25〇C, 3min, ramping to 72°C, over 3 min ；72°C, 2. 5min ； 94°C，15s ;68°C，Imin ;72°C，2. 5min ;94°C，15s ;68°C，Imin ;72°C，2. 5min ;94°C，15s ; 44°C，Imin ;72°C，2. 5min (15 个循环）； 72°C，8min ;12°C 保温。 B、不对称引物第二次扩增： 上步骤A中使用兼并引物AD3有扩增条带，以此产物为模板，使用带有限制性内切酶识 别位点的兼并引物AD' 3 5' -NGTASASWGTNAWCAACCCGGG-3'和所述SP2进行第一轮PCR扩 增，扩增体系为： TaqPlusPCR Master Mix 20ul， DNA 模板 2ul， 2* 引物（AD，和 SP2) 2ul， ddH20 16ul ； 扩增程序为： 94°C，30min ; 94°C，15s ;68°C，Imin ;72°C，2. 5min ;94°C，15s ;68°C，Imin ;72°C，2. 5min ;94°C，15s ; 44°C，Imin ;72°C，2. 5min (12 个循环）； 72°C，8min ;12°C 保温。 C、产物环化： 在上步骤B扩增得到的产物加入IOu Xma I酶切，酶切后用两倍体积乙醇沉淀后溶于 20ul ET中，再加入Iu T4连接酶，16°C保存过夜，再放入65°C保存lOmin，灭活连接酶，得到 环化产物。 D、PCR 扩增 以上步骤C环化得到的产物回收后为模板，以Fl和Dl为引物，普通PCR程序，扩增得 到的产物即为未知的侧翼片段。扩增体系为： TaqPlusPCR Master Mix 20ul， DNA 模板 2ul， 2* 引物（F^PDl) 2ul， ddH20 16ul〇 4、序列的测序比对 使用2%的非变性琼脂糖凝胶电泳检测扩增得到的未知侧翼片段，胶回收后将片段连 接至PMD18-T载体，检测阳性菌液后使用PMD18-T通用引物检测引物序列，并进行序列比 对。 表1兼并引物序列注释：S代表G/C，W代表A/T本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种获得已知序列侧翼未知序列的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)选择已知序列，设计两条方向一致的特异性引物，从远离边界序列到靠近边界序列的顺序依次标记为SP1和SP2，SP2带限制性内切酶识别位点，在SP2到边界序列之间再设计一对反向PCR引物F1和D1；(2)以基因组DNA为模板，以6种兼并引物AD分别和所述SP1进行第一轮PCR扩增，得到有扩增条带的PCR产物1； (3)以所述的有扩增条带的PCR产物1为模板，使用特异的SP2引物和步骤(2)中同种但加入限制性内切酶识别位点的相对应的兼并引物AD’扩增得到PCR产物2；(4) 将PCR产物2酶切后加入T4连接酶环化，以此为模板，使用F1和D1为引物，扩增得到PCR产物3，从所述PCR产物3中获得侧翼序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨琳，张君诚，付凤玲，李晚忱，宋育红，
申请(专利权)人：三明学院，
类型：发明
国别省市：福建;35