本发明专利技术涉及一种用于分离和鉴定Ac/Ds转座子侧翼序列的引物及方法。该引物为：a.用于分离Ac/Ds5’端侧翼序列的Ac末端特异性引物为SEQIDNO：1～SEQIDNO：7所示的碱基序列；b.用于分离Ac/Ds3’端侧翼序列的Ac末端特异性引物为SEQIDNO：8～SEQIDNO：14所示的碱基序列。本发明专利技术涉及一种用于鉴定区分Ac和Ds侧翼序列的特异性引物及方法，其特征在于该引物为：SEQIDNO：15～SEQIDNO：18所示的碱基序列。利用这些Ac特异性引物可以很好扩增获得基因组中的Ac或Ds的侧翼序列。这种检测方法操作简单，为大规模的获得Ac突变体的Ac侧翼序列和分离Ac插入突变体的基因的重要的技术手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用于分离和鉴定玉米Ac/Ds转座突变体中Ac/Ds转座子侧翼序列的特异性引物。
技术介绍
玉米是全球第一大粮食作物，是全世界主要的粮食来源。我国玉米的总产量已超过小麦，成为仅次于水稻的第二大粮食作物。而且玉米长期以来都是一种遗传模式植物。玉米B73基因组的序列测定已经完成，这将加快玉米方面的科学研究。预计在玉米中至少存在3. 2万个基因，这些基因的克隆和功能分析已成为下一个重要的挑战。在众多基因克隆的方法中，插入突变研究一种非常有效的手段。主要包括T-DNA插入突变和转座子插入突变。由于转基因技术的限制，在玉米中很难应用T-DNA插入法进行插入突变分析。但是在玉米存在内源的转座子是很好的进行插入突变研究的工具。目前在玉米中最主要的用于 创建插入突变体的转座子是Mutator (Mu)和Activator/Dissociator (Ac/Ds)两个系统。Mu因子具有转座频率高，正向突变率高和全基因组范围插入的特点，目前在国内外已有几个较大规模的Mu插入突变体库，并以用于玉米分离和克隆玉米基因。Ac/Ds虽然其转座频率较Mu转座子低，但其在玉米基因组拷贝数低，倾向于向连锁位点转座和倾向于插入低甲基化的基因富集区，近年来被作为与Mu互补的系统广泛的用于构建插入突变体库和进行基因的定向插入突变分析。在分离鉴定转座系和利用转座子标签法克隆基因的过程中，分离转座子的侧翼序列是一个重要的环节。传统的分离Ac/Ds侧翼序列的方法是以Ac或Ds的部分序列作为探针，通过Southern杂交来鉴定在每一个转座系材料中所对应的特异条带，然后回收特异条带区域的DNA并进行分子内的自连接，再通过反向PCR的方法来扩增特异条带，最后将侧翼条带测序并验证。这种方法对DNA的需要量大,而且做Southern和反向PCR是耗时费力的方法，难以提高实验效率。因此建立操作简单、快速高效的Ac/Ds侧翼序列分离和鉴定方法对于Ac/Ds插入突变体的鉴定和利用转座子标签法进行基因克隆都具有重要的意义。Siebert等利用一种部分双链的接头连接到经过酶切的平末端的DNA片段上,然后利用接头引物和基因特异性的引物通过嵌套PCR扩增基因上游或下游的序列。由于在接头的短链的3’末端用氨基封闭，减少了由于接头引物单独扩增带来的非目的条带，从而提高了 PCR产物的特异性。Ji和Braam利用产生3’突出端的内切酶酶切基因组DNA，然后利用在引物的3’端带有与突出末端互补碱基的接头引物和基因特异性引物扩增，这种方法中省去了连接的步骤，进一步提高了实验的效率。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种用于分离Ac/Ds转座突变体中Ac/Ds转座子侧翼序列的特异性引物。本专利技术的目的之二在于提供利用该特异性引物分离Ac/Ds转座突变体中Ac/Ds转座子侧翼序列的方法。本专利技术的目的之三在于提供一种用于鉴定上述Ac/Ds转座子侧翼序列是Ac还是Ds的侧翼序列的特异性引物。本专利技术的目之四在于提供利用该特异性引物区分鉴定Ac和Ds转座子侧翼序列的方法。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案 一种用于分离Ac/Ds转座子侧翼序列的特异性引物，其特征在于该引物为 a.用于分离Ac/Ds5’端侧翼序列的Ac末端特异性引物为SEQ ID NO :1 SEQ ID NO:7所不的喊基序列； b.用于分离Ac/Ds3’端侧翼序列的Ac末端特异性引物为SEQ ID NO :8 SEQ ID NO:14所不的喊基序列。一种分离Ac/Ds转座子侧翼序列的方法，采用上述的特异性引物，其特征在于该方法的具体步骤为 a.取10 15株植株的DNA等量混合后，进行限制性内切酶酶切，得到酶切产物； b.对于步骤a所得酶切产物，如是平末端产物，则连接平末端接头后，选择一种相应的Ac末端特异性引物和接头引物进行第一轮PCR扩增，得到扩增产物； c.将步骤b所得的PCR扩增产物经稀释后作为模板，再用第二轮Ac末端特异性引物和接头引物进行第二轮PCR扩增，得到Ac/Ds转座子侧翼序列。d.对于步骤a所得酶切产物，如是3’突出末端产物，则选择一种相应的Ac末端特异性引物和RSE接头引物进行第一轮PCR扩增，得到扩增产物； e.将步骤d所得的PCR扩增产物经稀释后作为模板，再第二轮Ac末端特异性引物和RSE接头引物进行第二轮PCR扩增，得到Ac/Ds转座子侧翼序列。上述步骤a得到的酶切产物为平末端，其连接接头的接头序列为由接头I和接头2退火获得；所述的接头I的序列为SEQ ID NO 19所不的喊基序列；所述的接头2的序列为SEQ ID NO :20所示的碱基序列；所述的第一轮PCR扩增的接头引物为SEQ ID NO :21所示的碱基序列。所述的第二轮PCR扩增的接头引物为SEQ ID NO :22所示的碱基序列。上述的步骤b中，对平末端的酶切产物的PCR扩增条件为94° C预变性3分钟，13 个循环(94° C 30 秒，72° C 20 秒-1° C/秒，72° C I 分钟)20 个循环(94° C 30 秒，57° C 20秒，72° C I分钟)，过度延伸72° C 8分钟。上述的步骤c中，对平末端的酶切产物的第一轮PCR产物的PCR扩增条件为94° C预变性3分钟，13个循环(94° C 30秒，72° C 20秒-1° C/秒，72° C I分钟)30个循环(94° C 30秒，57° C 20秒，72° C I分钟)，过度延伸72。C 8分钟。如上述的步骤a得到的酶切产物为3’突出端的酶切产物，其第一轮PCR扩增的接头引物为SEQ ID NO 23, SEQ ID NO :24或SEQ ID NO :25所示的碱基序列；其第二轮PCR扩增的接头引物为SEQ ID NO :26所示的碱基序列。上述的步骤a得到的酶切产物为3’突出端的酶切产物，其第一轮PCR扩增条件为94。C预变性3分钟，94° C 30秒，45° C 20秒，72° C 5秒钟，11个循环(94° C 30 秒，72° 0 20秒-1° C/秒，72° C I 分钟)20 个循环(94° C 30 秒，62° C 20 秒，72° CI分钟)，过度延伸72° C 8分钟。上述的步骤a得到的酶切产物为3’突出端的酶切产物，其第一轮PCR扩增条件为94。C预变性3分钟，13个循环(94° C 30秒，72。C 20秒-I。C/秒，72。C I分钟)25个循环(94° C 30秒，60° C 20秒，72° C I分钟)，过度延伸72。C 8分钟。一种用于鉴定区分Ac和Ds侧翼序列的特异性引物，其特征在于该引物为SEQID NO :15 SEQ ID NO 18所示的碱基序列。一种鉴定区分Ac和Ds侧翼序列的方法，采用上述的特异性引物，其特征在于该方法的具体步骤为 a.对于来自于aptl-ml::Ac和bz-m2(DI)系统的转座事件，我们可以用引物SEQ IDN0:17和SEQ ID NO :15和配合相应的侧翼序列的引物扩增。根据产物大小可判断侧翼序列是否是Ac的侧翼序列。即如以SEQ ID NO 17和对应的5’侧翼序列特异性引物进行扩增获得2670bp+5’侧翼序列长度的片断，并且SEQ I本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.ー种用于分离Ac/Ds转座子侧翼序列的特异性引物，其特征在于该引物为 a.用于分离Ac/Ds5’端侧翼序列的Ac末端特异性引物为SEQ ID NO :1 SEQ IDNO 7所不的喊基序列； b.用于分离Ac/Ds3’端侧翼序列的Ac末端特异性引物为SEQ ID NO :8 SEQ IDNO 14所不的喊基序列。2.一种分离Ac/Ds转座子侧翼序列的方法，采用根据权利要求I所述的特异性引物，其特征在于该方法的具体步骤为 a.取10 15株植株的DNA等量混合后，进行限制性内切酶酶切，得到酶切产物； b.对于步骤a所得酶切产物，如是平末端产物，则连接平末端接头后，选择ー种相应的特异性引物和接头引物进行第一轮PCR扩增，得到扩增产物； c.将步骤b所得的PCR扩增产物经稀释后作为模板，再用第二轮特异性引物和接头引物进行第二轮PCR扩增，得到Ac/Ds转座子侧翼序列； d.对于步骤a所得酶切产物，如是3’突出末端产物，则选择一种相应的特异性引物和RSE接头引物进行第一轮PCR扩增，得到扩增产物； e.将步骤d所得的PCR扩增产物经稀释后作为模板，再第二轮特异性引物和RSE接头引物进行第二轮PCR扩增，得到Ac/Ds转座子侧翼序列。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤a得到的酶切产物为平末端，其连接接头的接头序列为由接头I和接头2退火获得；所述的接头I的序列为SEQ ID NO: 19所示的喊基序列；所述的接头2的序列为SEQ ID NO 20所不的喊基序列；所述的第一轮PCR扩增的接头引物为SEQ ID NO 21所不的喊基序列； 所述的第二轮PCR扩增的接头引物为SEQ ID NO :22所示的碱基序列。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤b中，对平末端的酶切产物的PCR扩增条件为94° C预变性3分钟，13个循环(94° C 30秒，72° C 20秒-1° C/秒，72° C I分钟)20个循环(94° C 30秒，57° C 20秒，72° C I分钟)，过度延伸72。C 8分钟。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤c中，对第一轮扩增产物的PCR扩增条件为94° C预变性3分钟，13个循环(94° C 30秒，72° 0 20秒-1° C/秒，72° CI分钟)30个循环(94° C 30秒，57° C 20秒，72° C I分钟)，过度延伸72° C 8分钟。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤a得到的酶切产物为3’突出端的酶切产物，其第一轮PCR扩增的接头引物为SEQ ID NO 23, SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25所示的碱基序列；其第二轮PCR扩增的接头引物为SEQ ID NO :26所示的碱基序列。7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤a得到的酶切产物为3’突出端的酶切产物，其第一轮PCR扩增条件为94° C预变性3分钟，94° C 30秒，45° C 20秒，72° C 5秒钟，11个循环(94° C 30秒，72° C...
【专利技术属性】
技术研发人员：王飞，李鹏飞，徐大彬，郭圣明，赵志伟，樊军，宋任涛，许政暟，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：
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