一种批量获得基因组DNA中差异位点及其侧翼序列的方法技术

本发明专利技术公开了一种批量获得基因组DNA中差异位点及其侧翼序列的方法。该方法包括如下步骤：将基因组DNA甲和基因组DNA乙混合后杂交，用CELⅠ核酸内切酶对未形成双链区的单链DNA区进行酶切，回收酶切产物中目的范围大小的DNA片段进行自杂交；再进行DNA末端补平、加接头DNA、PCR扩增和测序，最后获得基因组DNA甲和基因组DNA乙的基因组DNA中的差异位点。本发明专利技术所提供的方法具有如下优点：效率高，通量大，成本低，一条阳性克隆可提供2处基因组DNA差异位点信息；操作简单方便，在测序前不需要使用复杂设备或昂贵的试剂；可广泛用于动物、植物和微生物品种间、品系间及癌症细胞与正常细胞间基因组DNA差异位点的检测分析。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种批量获得基因组DNA中差异位点及其侧翼序列的方法。
技术介绍
在物种进化过程中，不同物种间基因组的差异多表现为基因组的大小不同、染色体的重排、基因结构的改变、碱基插入、碱基删除以及大量的单碱基核苷酸突变(SNP );同一品种(系)不同个体的基因组差异主要表现为若干碱基的插入、删除以及大量SNP。这些不同形式的基因组差异或突变造成不同个体间存在较大的表型差异，一些碱基的突变甚至会造成疾病的发生以及生命体的发育终止。基因组差异位点的获得对于揭示不同个体或群体间表型不同的产生原因具有重要意义。目前，基因突变位点分析技术主要包括对已知突变位点检测技术和对未知突变位点的检测技术，其中，检测未知突变位点的技术包括单链构象多态性(SSCP)技术、变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术、sanger测序技术和高通量测序技术等；检测已知突变位点的技术有PCR-RFLP 酶切、等位基因特异 PCR(AS-PCR) ,SNP 芯片技术(Genechips) ,MassARRAY,Taqman探针法和质谱技术等。其中，高通量测序技术和芯片技术虽分析通量大，但成本高昂、需要特殊的仪器设备和试剂，而其余技术的分析通量又太小，均不能广泛应用于基因组差异分析。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种获得基因组DNA中差异位点及其侧翼序列的方法，包括如下步骤:I)将基因组DNA 甲和基因组DNA乙混合后进行分子杂交，使异源的单链DNA进行碱基配对并形成异源双链DNA区，收集杂交产物；2)用SI核酸内切酶酶切步骤I)所述杂交产物，收集酶切产物；3)回收步骤2)所述酶切产物中目的范围大小的DNA片段，获得不同大小的异源双链DNA片段的混合物，即混合DNA片段A ；4)将步骤3)所述混合DNA片段A进行分子杂交，使同源的单链DNA进行碱基配对形成同源双链DNA片段，收集杂交产物；5)将步骤4)所述杂交产物中的同源双链DNA片段进行末端补平，获得不同大小的同源双链DNA片段的混合物，即混合DNA片段B ；6)将步骤5)所述混合DNA片段B中的DNA片段两端连接相同的接头DNA，获得混合DNA片段C ；7)使用以步骤6)所述接头DNA序列设计的引物PCR扩增步骤6)所述混合DNA片段C，获得混合DNA片段D ;8)将所述混合DNA片段C中的DNA片段进行测序，将所述测序的结果进行序列比对，最后获得基因组DNA甲和基因组DNA乙中的差异位点及其侧翼序列；所述异源是指分别来自于所述基因组甲和所述基因组乙；所述同源是指均来自于所述基因组甲或所述基因组乙；所述混合DNA片段是指不同大小的DNA片段的混合物；所述将所述测序的结果进行序列比对按照包括如下步骤的方法进行:将所述测序的结果去除所述接头DNA序列后，再与所述基因组甲和所述基因组乙的同物种的已知基因组全部或部分序列比对。在上述方法中，步骤2)中所述SI核酸内切酶可为核酸内切酶CEL I。在上述方法中，步骤4)中所述分子杂交按照包括如下步骤的方法进行:将步骤3)所述混合DNA片段A依次进行如下处理:95°C 10分钟、70°C 10分钟、50°C 50分钟和40°C 50分钟。在上述方法中，步骤6)中所述接头DNA为由核苷酸序列分别为序列表序列I和序列2的两条单链DNA组成的互补双链核苷酸链。在上述方法中，步骤5)所述末端补平具体可通过T4DNA聚合酶实现。在上述方法中，步骤3)所述目的范围大小可为50bp — 10kb。在上述方法中，步骤I)所述分子杂交按照包括如下步骤的方法进行:将基因组DNA甲和基因组DNA乙混合后依次进行如下处理:98°C 10分钟、70°C 10分钟、50°C 50分钟、40 0C 50 分钟。 在上述方法中，所述基因组DNA甲和基因组DNA乙来源于同一种、品种或品系的动物、植物或微生物。在上述方法中，所述基因组DNA甲来源于阿勒泰羊，所述基因组DNA乙来源于中国美利奴羊新疆军垦细毛羊。本专利技术还提供了一种构建基因组DNA差异位点及其侧翼序列的DNA文库的方法，包括上述任一所述方法中的所述步骤I) 一7)。实验证明，使用本专利技术所提供的方法，获得了含粗毛羊(阿勒泰羊)和细毛羊(中国美利奴羊新疆军垦细毛羊)的基因组DNA之间差异序列位点及其侧翼序列信息的DNA片段D的阳性克隆2000个，随机取5个阳性克隆对其DNA片段D进行测序，去除两端的接头序列，获得4个不同的DNA片段B的序列。经测序分析，每个所述DNA片段B上的两端序列或每个DNA片段B两侧外的临近序列均为粗羊毛基因组DNA和细羊毛基因DNA的两个不同差异位点序列。本专利技术所提供的方法具有如下优点:操作简单方便，在测序前不需要使用复杂设备或昂贵的试剂，也不需要进行引物设计，通过自杂交和末端补平以及添加接头的步骤就可将含差异位点和侧翼序列的不同DNA片段(即DNA文库)连接到克隆载体上；效率高，通量大，成本低，一条阳性克隆可提供2处基因组DNA差异位点及其侧翼序列的信息；适用范围广，可用于农业动物(猪、马、牛、羊和鸡等)品种、品系间基因组DNA未知差异位点的检测，还可用于性状差异较大的植物-植物、微生物-微生物间的未知差异位点分析及癌症细胞与正常细胞间未知的基因组DNA序列差异。附图说明图1为一条DNA片段B的测序结果(已除去接头序列)。其中，左框线内的序列与图2中左上图和左下图中的右端部分序列相同，右框线内的序列与图2中右上图和右下图中的左端部分序列相同。图2为细毛羊和粗毛羊的基因组DNA序列中对应于图1所不序列的左侧及左侧外的部分序列(左上图和左下图)，及细毛羊和粗毛羊的基因组DNA序列中对应于图1所示序列的右侧及右侧外部分序列(右上图和右下图)。结果显示，在细毛羊和粗毛样的基因组DNA对应于图1所示序列的左侧外存在一个碱基突变(左框线处)，在该位点，细毛羊的基因型为TT纯合，粗毛羊的基因型为GG纯合；在细毛羊和粗毛样的基因组DNA对应于图1所示序列的右侧外存在一个碱基突变(右框线处)，在该位点，细毛羊的基因型为TC杂合(用N表示)，粗毛羊的基因型为TT纯合。图1和图2的结果说明，在该DNA片段B的左侧外的一个碱基和右侧外的一个碱基分别为细毛羊和粗毛羊的基因组DNA的两个不同突变位点。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、批量获得基因组DNA中的差异位点1、基因组DNA的获得按照文献(卢圣栋.现代分子生物学实验技术.北京:中国协和医科大学出版，1999年)中的酚-氯仿抽提DNA的方法分别提取粗毛羊(阿勒泰羊)和细毛羊(中国美利奴羊新疆军垦细毛羊)耳组织的基因组DNA，用ddH20将基因组DNA的终浓度均稀释为200ng/u L0 2、基因组DNA的杂交取等量的步骤I获得的粗、细毛羊基因组DNA (各5 L，即I g基因组DNA))混合，按照如下反应体系和条件进行分子杂交:杂交反应体系:1 ii L50XDenhardt’ s (购自invitrogen公司，产品目录编号为750018),2.5 u L20XSSC (溶剂为水，溶质及其浓度分别为:氯化钠3.0mol/L，柠檬酸钠0.3mol/L)、5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种获得基因组DNA中差异位点及其侧翼序列的方法，包括如下步骤：1）将基因组DNA甲和基因组DNA乙混合后进行分子杂交，使异源的单链DNA进行碱基配对并形成异源双链DNA区，收集杂交产物；2）用S1核酸内切酶酶切步骤1）所述杂交产物，收集酶切产物；3）回收步骤2）所述酶切产物中目的范围大小的DNA片段，获得不同大小的异源双链DNA片段的混合物，即混合DNA片段A；4）将步骤3）所述混合DNA片段A进行分子杂交，使同源的单链DNA进行碱基配对形成同源双链DNA片段，收集杂交产物；5）将步骤4）所述杂交产物中的同源双链DNA片段进行末端补平，获得不同大小的同源双链DNA片段的混合物，即混合DNA片段B；6）将步骤5）所述混合DNA片段B中的DNA片段两端连接相同的接头DNA，获得混合DNA片段C；7）使用以步骤6）所述接头DNA序列设计的引物PCR扩增步骤6）所述混合DNA片段C；8）将所述混合DNA片段C中的DNA片段进行测序，将所述测序的结果进行序列比对，最后获得基因组DNA甲和基因组DNA乙中的差异位点及其侧翼序列；所述异源是指分别来自于所述基因组甲和所述基因组乙；所述同源是指均来自于所述基因组甲或所述基因组乙；所述混合DNA片段是指不同大小的DNA片段的混合物。...

【技术特征摘要】
1.一种获得基因组DNA中差异位点及其侧翼序列的方法，包括如下步骤: 1)将基因组DNA甲和基因组DNA乙混合后进行分子杂交，使异源的单链DNA进行碱基配对并形成异源双链DNA区，收集杂交产物； 2)用SI核酸内切酶酶切步骤I)所述杂交产物，收集酶切产物； 3)回收步骤2)所述酶切产物中目的范围大小的DNA片段，获得不同大小的异源双链DNA片段的混合物，即混合DNA片段A ； 4)将步骤3)所述混合DNA片段A进行分子杂交，使同源的单链DNA进行碱基配对形成同源双链DNA片段，收集杂交产物； 5)将步骤4)所述杂交产物中的同源双链DNA片段进行末端补平，获得不同大小的同源双链DNA片段的混合物，即混合DNA片段B ； 6)将步骤5)所述混合DNA片段B中的DNA片段两端连接相同的接头DNA，获得混合DNA片段C ； 7)使用以步骤6)所述接头DNA序列设计的引物PCR扩增步骤6)所述混合DNA片段C ； 8)将所述混合DNA片段C中的DNA片段进行测序，将所述测序的结果进行序列比对，最后获得基因组DNA甲和基因组DNA乙中的差异位点及其侧翼序列； 所述异源是指分别来自于所述基因组甲和所述基因组乙； 所述同源是指均来自于所述基因组甲或所述基因组乙； 所述混合DNA片段是指不同大小的DNA片段的混合物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤2)中所述SI核酸内切酶为核酸内切酶C...

【专利技术属性】
技术研发人员：甘尚权，高蕊，沈敏，王新华，刘守仁，
申请(专利权)人：新疆农垦科学院，
类型：发明
国别省市：