一种四倍体野生稻中涉及逆转座子插入的直向同源基因验证方法技术

本发明专利技术公开了一种四倍体野生稻中涉及逆转座子插入的直向同源基因验证方法。根据两种假定进行引物位置设计，是本发明专利技术能够成功的重要一步；由于该四倍体中两个直向同源基因编码区序列相似性高达97.8%，通过优化设计的合理的引物序列使PCR反应只扩增目标的J16h8基因相关片段，而不扩增其直向同源基因（J16j7）是本发明专利技术成功的关键。根据特异引物扩增产物测序结果断定，该重复序列的插入并没有影响J16h8基因的转录。本发明专利技术所设计的引物及相关试验方法解决了涉及转座子或逆转座子插入的四倍体中直向同源基因结构验证的困难，在多倍体基因注释、基因功能研究领域具有比较重要的指导作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学
的基因结构验证方法，特别涉及一种通过引物优化设计来验证四倍体中直向同源基因是否涉及逆转座子插入的方法。
技术介绍
通过转座子或逆转座子活动形成新基因是生物基因组进化的重要方式之一。由于自主型转座子或逆转座子本身含有编码区，故而在基因组序列注释中经常出现注释出来的基因与转座子或逆转座子相关，如粳稻日本晴基因组中有30.26%（16941/55986）的注释基因涉及到了转座子或逆转座子（http://rice.plantbiology.msu.edu/）；玉米基因组中有50%以上的基因其启动子或转录区域涉及到转座子或逆转座子。对于多倍体植物来说，同一物种内不同亚基因组间直向同源基因对儿成员之一如果涉及转座子或逆转座子则对其进行基因结构验证是十分困难的，因为直向同源基因对除在转座子或逆转座子插入位点序列不一样外，其余编码区（CDS）部分的序列相似性是很高的。这就造成了涉及转座子或逆转座子插入的多倍体中直向同源基因结构验证的困难，目前还没有发现相关简便验证方法的报道。
技术实现思路
本专利技术通过特殊设计的引物及相应试验实现了对一种四倍体野生稻中涉及逆转座子插入的直向同源基因结构的检测与验证。直向同源基因中逆转座子插入鉴定在进行稻属植物MOC1同源区研究中发现一种四倍体（基因组类型为CCDD）野生稻O.alta的注释基因（编号为J16h8，位于DD亚组）的第三个内含子中含有逆转座子编码的三个较大的外显子（图1，图4B），而位于CC亚组的其直向同源基因J16j7不含有这三个涉逆转座子的外显子（图2，图4A）。重复序列注释发现（图1），该三个较大的外显子序列与插入到此位置的一个逆转座子序列重合。该逆转座子的LTR长度为238bp，相似性为100%（图3），插入位点特征重复序列（TSD）为CAAAC，另外还具有PBS、PLA等逆转座子特征序列，包含LTR在内的总长度为4481bp（从49248到53728）。序列比对结果表明，该逆转座子编码区序列与重复序列数据库中的Ty1-copia-like类逆转座子相似性显著，但LTR没有找到匹配序列。因此，插入J16h8的逆转座子可能属于Ty1-copia一类的目前尚未被报道过的新的逆转座子，并且在进化上属于近期插入的。由于逆转座子具有编码区，因此，基因注释软件在进行DD亚组MOC1同源区序列注释时将该逆转座子的编码区整合进J16h8基因了。由逆转座子活动造成基因组序列变异产生新基因是生物进化的重要驱动力。此处发现的涉逆转座子插入的基因是否由上述机制产生的新基因？这一逆转座子插入是否对该基因的转录造成影响？这些问题的解决都需要进行基因结构检测与验证。鉴定引物设计本专利技术通过考察该直向同源基因对的序列比对结果，根据PCR扩增的特点设计了比较高效的序列特异的专用引物。具体来说，引物设计是通过如下技术方案实现的：找到基因组型为CCDD的四倍体野生稻MOC1同源区中涉及逆转座子插入的直向同源基因对（J16h8--J16j7），进行序列比对（图5），确定涉及逆转座子编码的外显子（图4B，黑色向上箭头所指三个较长的外显子）。根据两种假定进行引物设计。假定1：J16h8确实是由逆转座子活动而产生的融合有逆转座子编码区的新基因，引物设计可以按照图4B中粗线六角星、粗线五角星、粗线四角星所示位置进行，其产物大小分别为311bp、807bp、1125bp。假定2：J16h8的基因结构与CC亚组中的直向同源基因（J16j7）结构相同，J16h8中的逆转座子相关序列在转录加工过程中被拼接除去，因而该逆转座子对宿主基因的转录没有影响。这种情况下引物设计见图5（横向箭头的尾部标有相同星型的为一个引物对）、图4A（相应图中横向箭头或数字下标有相同星型的为一个引物对），产物大小见图4C，分别为217bp（细线五角星）、183bp（细线六角星）、1011bp（细线四角星）。由于该四倍体中两个直向同源基因编码区序列相似性高达97.8%，如何设计合理的引物使PCR反应只扩增目标的J16h8基因相关片段，而不扩增其直向同源基因（J16j7）是试验成功与否的关键。相应引物设计的位置如上所述，引物序列见表1。表1引物信息表引物名称引物序列产物大小bp3ex-1in-807SGTCATCCCAGATAATACTGCATT8073ex-1in-807AGCCACCCTTCTTGGTGTTA2ex-1in-1125SCGGGAAGAAAGTACAGACGTATT11252ex-1in-1125AGAGCGAAGGCGGTATTGG3in-4ex-311SCACCACAAGCGAACGAAG3113in-4ex-311ACTGACATACTCTCCACCTGATAG3ex5-217SGTCATCCCAGATAATACTGCATT2173ex5-217ATTCGCAGAAAGGACACCA1ex3-183SCGTTAATTTTGTCATCCGT1831ex3-183AAATGCAGTATTATCTGGGAT5ex14-1011SCAAATGTGTGGTGTCCTTTC10115ex14-1011AGGTATAGCGAGCGGTTTC基因结构验证结果四倍体野生稻O.alta（CCDD）的J16h8基因被一个长约4.5kb的逆转座子插入到第3个内含子中（图4B）。为了检验长约4.5kb的重复序列插入对该基因结构与转录的影响，采用特殊设计的引物进行了RT-PCR试验。引物设计位置见图5及图4A、图4B，扩增结果见图4C。测序结果表明（图6~图8），该重复序列插入并没有影响O.alta（CCDD）中J16h8基因的转录。O.alta（CCDD）中2个直向同源基因尽管其中一个被长约4.5kb的逆转座子插入但它们在基因转录水平上都是正常的，至于它们能否最终行使正常的基因功能，还需进一步深入研究。附图说明图1是J16（上）与J16h8（下，DD亚组）直向同源基因外显子-内含子结构比较；图1注：该图由ACT（ArtemisComparisonTool）软件展示，图的上面是粳稻日本晴MOC1同源区的J16基因区段，下面为四倍体（CCDD）野生稻O.alta的DD亚组中J16h8基因区段；上下直向同源基因区段间用线连接的部分表示序列比对相似性在显著水平以上（1e-20，80%以上）；图中标尺刻度数据为两个直向同源基因区段所在MOC1同源区的实际位置；标尺刻度的上下各三行表示DNA正义链、反义链各三个翻译框，六个翻译框中黑色的短竖线表示终止密码子，位于不同翻译框中的小方框表示外显子，用折线链接，末端外显子的小三角表示该基因的转录方向；与J16同源基因区段相比DD亚组的同源区中插入了逆转座子，该逆转座子两侧的深色方框表示LTR，中间的方框表示逆转座子除LTR外的中间部分。图2说明除没有逆转座子外均同图1。图2是J16（上）与J16j7（下，CC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种四倍体野生稻中涉及逆转座子插入的直向同源基因验证方法，其特征在于：根据两种假定进行特异引物设计，假定1：J16h8确实是由逆转座子活动而产生的融合有逆转座子编码区的新基因，可以将逆转座子编码的外显子序列及相邻的原基因外显子序列作为模板进行上下游特异引物设计；假定2：J16h8的基因结构与CC亚组中的直向同源基因J16j7结构相同，J16h8中的逆转座子相关序列在转录加工过程中被拼接除去，因而该逆转座子对宿主基因的转录没有影响，这种情况下以插入位点两侧的外显子序列为模板进行特异引物设计。

【技术特征摘要】
1.一种四倍体野生稻中涉及逆转座子插入的直向同源基因验证方法，其特征在于：根据两种假定进行特异引物设计，假定1：J16h8确实是由逆转座子活动而产生的融合有逆转座子编码区的新基因，可以将逆转座子编码的外显子序列及相邻的原基因外显子序列作为模板进行上下游特异引物设计；假定2：J16h8的基因结构与CC亚组中的直向同源基因J16j7结构相同，J16h8中的逆转座子相关...

【专利技术属性】
技术研发人员：张胜利，李东方，胡铁柱，赵新亮，刘明久，周岩，
申请(专利权)人：河南科技学院，
类型：发明
国别省市：河南;41