用于修饰核酸的转座子末端组合物和方法技术

本发明专利技术提供了使用转座酶和转座子末端在体外产生双链靶ＤＮＡ的广泛断裂和５′加标签、然后不经ＰＣＲ扩增反应使用ＤＮＡ聚合酶产生５′和３′加标签的单链ＤＮＡ片段的方法，组合物和试剂盒，其中５′端上的第一标签显示转移的转座子末端的序列以及任选的另外的任意序列，并且３′端上的第二标签显示与第一标签显示的序列不同的序列。所述方法可用于产生５′和３′加标签的ＤＮＡ片段以用于多种过程，包括用于环境样品中的ＤＮＡ的宏基因组分析、ＤＮＡ的拷贝数变异（ＣＮＶ）分析以及包括大规模平行ＤＮＡ测序（所谓的“下一代测序”）在内的比较基因组测序（ＣＧＳ）的过程。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及使用转座酶和转座子末端组合物从靶DNA产生加标签的DNA片段的文库的方法、组合物和试剂盒。所产生的ssDNA片段可用作模板，例如用于多种应用，包括，例如高通量的、大规模平行的和/或多重的DNA测序。
技术介绍
存在多种方法和应用，对这些方法和应用而言，从双链DNA (dsDNA)靶分子产生断裂的且加标签的DNA分子的文库是令人期望的。通常，目的是从较大的dsDNA分子产生较小的单链DNA(ssDNA)分子(例如DNA片段)以用作DNA或RNA聚合酶反应中的模板(例如，用作DNA测序反应或DNA或RNA扩增反应中的模板，在这些扩增反应中引物与标签退火并通过聚合酶延伸)。直到最近，使用桑格双脱氧链终止测序法进行大多数的DNA测序，在该方法中，使用待测序的DNA作模板通过聚合酶延伸引物。进行四种反应，每种具有全部规范的核苷酸 (dATP、dCTP、dGTP、和dTTP)的混合物和四种链终止的双脱氧核苷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP 或ddTTP)之一，并且每种反应产生开始于引物且终止于双脱氧核苷酸的一组嵌套的链终止的片段。当这些链终止的DNA分子在电泳后按大小分离时，掺入ddNTP的次序反映模板 DNA的序列。使用这些方法，可确定距引物位点数百碱基或上千碱基的序列。较大序列的确定需要由来自众多克隆的重叠信息将较大序列拼接在一起。因为这些传统方法需要大量DNA模板，并且因为如果大量非模板DNA存在那么这些方法产生的结果不佳，所以通常使用克隆的或扩增的DNA进行桑格双脱氧测序。例如，在正式开始于1990年并且在2000年以人类基因组序列‘草图’的完成宣告结束并且在2006 年公布最后一条人类染色体的序列的人类基因组计划(Human Genome Project)过程中进行的大部分测序是基于使用由宿主细菌的群体构成的基因组文库，每个宿主细菌携带被克隆到DNA载体中的DNA分子，以致各自携带一段基因组DNA的所有DNA克隆的集合代表整个基因组。这是枯燥的和高度反复的过程，涉及大量DNA克隆(例如，BAC克隆)的构建和堆积，进而常常对这些DNA克隆进行亚克隆以产生用作测序模板的较小DNA克隆的文库。通常，将这些方法中使用的引物设计成与载体退火，以致这些引物将在测序反应过程中延伸到未知的克隆DNA中。这种方法允许相同的引物组用于分析许多不同的克隆。为了降低人类基因组测序计划所需亚克隆的量，有时使用的一种方法为“体外转座”。体外转座方法包括使用称作转座子的可移动遗传元件来将小段已知序列的DNA插入未知DNA的中间。该方法包括将来自基因组文库的DNA克隆与转座子在发生转座子单次插入DNA克隆中的条件下孵育，然后以体外转座反应的等分部分转化大肠杆菌细胞，并选择包含由该转座子所编码的标志物诸如抗生素抗性标志物的细胞。因此，体外转座反应从 DNA母克隆中产生“转座子插入克隆”的文库，每个转座子插入克隆包含在该DNA克隆中的不同位置插入的转座子。然后使用每种DNA链的不同引物从每个转座子末端向外对每个插入克隆测序。如以上所述，通过重叠从不同插入克隆获得的序列构建DNA母克隆的完整序列。使用人类基因组计划的这种转座子插入法的实例由Butterfield，YSN等人，Nucleic Acids Res 30 :2460_2468，2002 ;Shevchenko，Y 等人，Nucleic Acids Res 30:2469-2477， 2002 ；以及Haapa，S等人，Genome Res 9 :308_315，1999描述。人类基因组计划的体外转座方法的使用使基因组DNA克隆和由基因组DNA编码的mRNA产生的cDNA克隆的完整测序变得容易。然而，这种体外转座法的一个缺点是它并非完全在体外，因为它需要转化大肠杆菌细胞、选择包含转座子插入的大肠杆菌菌落、以及随后从用于测序的转座子插入克隆中分离DNA的步骤。为了消除用等分部分的体外转座反应转化大肠杆菌并且在选择性培养基上培养该大肠杆菌细胞以获得转座子插入克隆的要求，Teknanen等人(美国专利第6，593，113 号)开发了基于完全体外转座子方法，包括体外转座反应和选择测序模板的PCR扩增反应。 根据Teknanen等人，在其方法中使用的检验的DNA或靶DNA可以在数个碱基对到最多40 千碱基对，不使用甚至更长的DNA片段作靶DNA的唯一限制因素是扩增反应诸如PCR不能扩增更长片段。因此，在使用这种方法产生测序模板的一些实施方案中，首先使至多约40Kb 的检验的DNA或靶DNA经历体外转座反应，然后使用与该靶DNA中的已知序列互补的固定引物或如果该靶DNA被克隆在载体中与该载体中的序列互补的固定引物作为第一 PCR引物，并使用与该靶DNA接合(join)的转座子末端的序列互补的选择性引物任选地加上在其 3'端具有已知身份的一至十个额外的核苷酸作为第二 PCR引物，进行PCR扩增。在另一个实施方案中，两种选择性引物用于PCR扩增步骤，它们中的至少一种在其3'端具有已知身份的一至十个额外的核苷酸。Teknanen等人的方法提供为桑格测序提供了某些益处，因为它们消除了使用大肠杆菌细胞来选择具有转座子插入的DNA分子的需要。然而，这些方法限于大小至多约40Kb的靶DNA，由于固定引物或选择性引物的使用，这些方法选择只表现出由该靶DNA表现出的序列的一部分的DNA分子。因此，尽管这些方法可用于桑格测序，但它们不适合于产生用于更新的“下一代” DNA测序方法的测序模板，所述“下一代” DNA测序方法能够在使用大规模平行或多重形式的单次测序操作中从高达数百万测序模板中产生序列数据。下一代测序平台包括454 FLX 、或 454 TITANIUM (Roche)、S0LEXA 基因组分析仪(Illumina)、HELISC0PE 单分子测序仪(Helicos Biosciences)和 SOLID DNA 测序仪(Life Technologies/Applied Biosystems)仪器)，以及仍处于由诸如 Intelligent Biosystems和I^acific Biosystems等公司研发之下的其他平台。尽管产生序列信息的化学对于不同的下一代测序平台而言是不同的，所有这些下一代测序平台共有从极其大量的测序模板中产生序列数据的共同特征，在这些测序模板上测序反应同时运行。一般来说，来自所有这些测序反应的数据使用扫描仪收集，然后使用计算机和强大的生物信息程序进行装配并进行分析。测序反应以“大规模平行”或“多重”的方式执行、读数、装配并进行分析。 这些仪器的大规模平行的性质需要在思考以下问题上的转变需要哪种测序模板和如何产生它们以便从这些强大的仪器获得最大可能的测序数据量。因此，不需要大肠杆菌中的DNA克隆的基因组文库，现在有必要考虑关于产生DNA片段文库的体外系统，所述DNA片段文库包括从样品中的靶DNA产生的DNA片段的集合或群体，其中在该集合或群体中的全部DNA 片段的组合显示的序列是产生这些DNA片段的靶DNA的序列的质量上和/或数量上的代表。实际上，在一些情况下，有必要考虑关于产生由多个基因组DNA片段文库构成的DNA片段文库，所述多个本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于产生靶ＤＮＡ的加标签的ＤＮＡ片段的文库的方法，所述方法包括：ｉ）将所述靶ＤＮＡ与转座酶和转座子末端或转座子末端组合物孵育，所述转座子末端或转座子末端组合物包含在其５′部分中具有标签域的转移链，所述孵育在其中所述转座酶催化转座反应的条件下进行，其中：ａ）所述靶ＤＮＡ被断裂产生多个靶ＤＮＡ片段；和ｂ）所述转座子末端或转座子末端组合物的转移链与多个所述靶ＤＮＡ片段中的每一个片段的５′端接合产生多个５′加标签的靶ＤＮＡ片段；和ｉｉ）将所述多个５′加标签的靶ＤＮＡ片段与至少一种核酸修饰酶孵育，所述孵育在其中３′标签与所述５′加标签的靶ＤＮＡ片段的３′端接合的条件下进行，以产生包含加双标签的靶ＤＮＡ片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰罗马·箭之撒，
申请(专利权)人：阿霹震中科技公司，
类型：发明
国别省市：US