茶尺蠖反转录转座子基因ｒｔｐ及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种茶尺蠖反转录转座子基因ｒｔｐ，其具有ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ：１所示的核苷酸序列。本发明专利技术还公开了上述基因ｒｔｐ编码的蛋白质，其具有ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２所示的氨基酸序列。本发明专利技术还公开了上述基因ｒｔｐ的用途：利用该基因物调节鳞翅目害虫的抗病毒性能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于昆虫基因工程领域。具体的说，本专利技术涉及一种茶尺蠖反转录转座子(retrotransposon， rtp)基因分离和分析；还涉及利用该基因进行调节茶尺蠖对病毒抵御能 力。
技术介绍
茶尺蠖是主要茶园虫害之一，因此也是重要的防治对象。随着茶园管理的无公害化和 有机化，化学合成农药的使用受到限制或禁止，而生物农药则成为大力推广的制剂。核型 多角体病毒(NPV)是常用防治茶尺蠖的生物农药。研究显示，NPV对幼龄茶尺蠖有较好 防效，但对3龄以上幼虫作用较小。高龄茶尺蠖对NPV产生抗性的原因的探索，将有助 于该生物农药的合理、高效使用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种茶尺蠖反转录转座子基因rtp以及该基因编码的 蛋白质，该基因物的活性与不同龄期茶尺蠖害虫的抗病毒性能密切相关，可用于明确不同 龄期茶尺蠖对NPV的耐受性原因。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种茶尺蠖反转录转座子基因rtp，其具有SEQID No: l所示的核苷酸序列。本专利技术还同时提供了上述基因rtp编码的蛋白质，其具有SEQIDNO: 2所示的氨基酸 序列。本专利技术还同时提供了上述基因rtp的用途，利用该基因物调节鳞翅目害虫的抗病毒性能。作为本专利技术基因rtp用途的改进病毒为核型多角体病毒。 作为本专利技术基因rtp用途的进一步改进鳞翅目害虫为茶尺蠖。作为本专利技术基因rtp用途的进一步改进将根据SEQIDNo: l所示的核苷酸序列设计的 rtpsiRNA注射入茶尺蠖体内，使内源rtp表达下调，达到茶尺蠖抗病毒能力下降。本专利技术通过分子生物学技术手段分离和分析与鳞翅目害虫抗病毒性能密切相关的基 因，为鳞翅目害虫NPV等生物农药的增强剂的研发奠定基础。本专利技术是采用cDNA-AFLP 和RT-PCR技术分离茶尺蠖等鳞翅目害虫与抗病毒性能有密切关系的基因rtp;证明rtp基因 表达与鳞翅目害虫不同龄期的抗病毒能力密切相关。实现本专利技术的具体技术步骤如下一、茶树鳞翅目害虫rtp基因分离和分析分别取高、低不同龄期茶尺蠖幼虫若干头。以TRIZOL (Invitrogen公司)试剂提取总 RNA，并以UNIQ-10柱式mRNA抽提纯化试剂盒(上海生工生物工程有限公司)分离mRNA。 分别取l-5吗mRNA进行cDNA合成，双链cDNA合成采用TakaRa MMLV RTase cDNA Synthesis Kit (宝生物工程有限公司)进行。双链cDNA经异丙醇沉淀纯化后，以TakaRa BspHI/BssHII (宝生物工程有限公司)组合酶切消化。消化后的片段与事先设计的2 个接头SEQIDNo: 3和SEQIDNo: 4，以T4DNA连接酶(上海生工生物工程有限公司) 连接。以连接完成的cDNA片段为模板，以预扩增引物SEQIDNo: 5和SEQIDNo: 6进行 PCR预扩增。将预扩增产物适当稀释后，以选择性扩增引物组合SEQ ID No: 7和SEQ ID No: 8，进行选择性扩增。扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，以核酸银染试 剂盒(上海生工生物工程有限公司)进行显带。从凝胶上割取在低幼虫龄无表达或弱表达、而在高龄期幼虫有强表达的对应条带。割 取目标带，以纯水浸提过夜后，取适量浸提液作为模板，以SEQIDNo: 7和SEQIDNo: 8 引物组合进行PCR，产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳。电泳结束后割取目标条带，以UNIQ-IO 柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程有限公司)进行片段回收，并插入pUCm-T载 体(上海生工生物工程有限公司)，阳性克隆委托Irwitrogen公司进行序列分析，确定了其 中一个157bp的显著差异序列与茶尺蠖龄期发育密切相关的片断，经与美国生物信息数据 库http:〃www. ncbi.nlm.nih.gov比对，证实该序列与家蚕等反转录转座子具有较高同源性， 具体序列如SEQIDNo:9。以此片断以及检索到的家蚕rtp为基础，重新设计了2对引物，即 SEQIDNo: 10和SEQIDNo: 11、SEQIDNo: 12和SEQIDNo: 13。以4龄茶尺蠖幼虫cDNA 为模板，以上述2对引物进行PCR。两个PCR产物分别插入pUCm-T载体中，委托Invitrogen 进行序列分析，得到了长度分别1214bp和1046bp的2段序列。经S叫Man软件(DNAStar公 司)对上述片断进行拼接，剔除中间长157bp的重叠区序列，获得了长度为2104bp的可读序 列，具体如SEQIDNo:l。经与美国生物信息数据库http:/Zwww. ncbi.nlm.nih.gov比对证实，该序列与家蚕等昆虫的反转录转座子具有较高同源性。因此将该序列定名茶尺蠖rtp基因；经过EditSeq软件推演得到了包含700氨基酸的蛋白序列，具体如SEQ ID No:2。 二、 rtp基因表达与茶尺蠖抗病毒性能的关系将NPV病毒制剂用水稀释成常规使用浓度，即2.0X10S-2.0Xl()SpiB/毫升，以稀释后 的病毒液涂抹茶叶正面和反面，以带病毒的茶叶饲喂不同龄期茶尺蠖，分析其对病毒的耐 受性，同时研究rtp的表达情况。结果显示，当采用常规浓度处理l龄茶尺蠖幼虫时，幼虫 死亡率在95%以上，而相同的浓度处理2龄幼虫时，其病死比例约为60-80%，处理3龄幼虫 时病死比例只占处理总数20-40%，而4龄幼虫经病毒处理后病死率在20%以下。基因表达 分析显示，在l龄时茶尺蠖幼虫的rtp基因几乎不表达，随着发育龄期增加，该基因表达逐 渐加强。说明该基因的表达活性与茶尺蠖的抗病毒有很强的相关性，即rtp表达强则茶尺蠖 抗病毒能力强，反之亦然。进一步以siRNA技术研究了rtp基因表达对茶尺蠖抗病毒能力的影响。结果显示，以人 工体外合成的rtp-siRNA注射高龄茶尺蠖后，再以常规浓度的NPV词喂，高龄幼虫的抗病毒 能力大大降低，其死亡率达到65%以上，而未注射rtp-siRNA的对照，病毒饲喂后的死亡率 仍在40%以下。可见rtp的正常表达与茶尺蠖等鳞翅目害虫的抗病毒能力有密切关系。上述研究证实，rtp表达与茶尺蠖的抗病毒能力呈正相关，rtp表达强，幼虫抗病毒能力 强。而且rtp作用机制为rtp通过自身表达，实现反转录和转座行为，活化被插入下游的抗 病毒基因活性，从而使高龄幼虫具有强的抗病毒能力。 一旦rtp表达受到抑制，下游相关基 因无法活化，幼虫抗病毒能力下降。附图说明 下结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。图1是由SEQ ID No: 7和SEQ ID No: 8引物组合所获得的低龄和高龄茶尺蠖幼虫 cDNA-AFLP差异条带的显示图；注其中M为分子量标记，A为l龄茶尺蠖幼虫，B为4龄茶尺蠖幼虫；黑色箭头所 示为目标条带(分子量约为150bp)。图2是以SEQ ID No: 14和SEQ ID No: 15引物组合PCR所得的不同龄期茶尺蠖中rtp 的表达情况显示图；注图中RNA为18sRNA，作为基因表达的背景参照。M为分子量标记，1为1龄幼 虫，2为2龄幼虫，3为3龄幼虫，4为4龄幼虫。具体实施方式 实施例l:取1龄后期幼虫10头和4龄期茶尺蠖幼虫2头，以TRIZOL (Invitrogen本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种茶尺蠖反转录转座子基因ｒｔｐ，其特征是：具有ＳＥＱＩＤＮｏ：１所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陆建良，林晨，梁月荣，董占波，郑新强，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]