描述了对人DNA样品中存在的降解程度进行定量的方法。该方法利用实时PCR系统以对样品中第一反转录转座子散布元件和相对较长的第二反转录转座子散布元件分别进行定量，其中随着所述样品降解，所述较长的元件预期以比所述较短元件更快的速度瓦解。在一实施方案中，该方法利用(在进化水平上)相对年轻的Alu Yb系亚家族序列在每个人基因组中的出现以及它们在非人样品中的基本上不存在。在优选实施方案中，该方法对“SVA”元件的较长的290bp的序列和Alu Yb8系的较短的80bp的序列进行定量。介绍了在该方法中有用的新设计的引物和TaqMan探针。相关方法还对男性特异性人DNA进行定量。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】开发用于评估法医样品中DNA降解和质量的高灵敏度定量 系统 优先权声明 本申请引用于2012年8月13日根据35U.S.C. § 111(b)作为临时申请向美国专 利与商标局在先提交并且按期分配序列号61/682, 507号的申请DEVELOPMENT OF A HIGHLY SENSITIVE QUANTIFICATION SYSTEM FOR ASSESSING DNA DEGRADATION AND QUALITY IN FORENSIC SAMPLES(开发用于评估法医样品中DNA降解和质量的高灵敏度定量系统）， 于2013年2月21日根据35U.S.C. § 111(b)作为临时申请向美国专利与商标局在先提 交并且按期分配序列号61/767,668号的相同标题的另一申请，和于2013年3月15日根 据35U.S.C. § 111(b)作为临时申请向美国专利与商标局在先提交并且按期分配序列号 61/793, 595号的相同标题的第三申请，将它们并入本文，并且要求根据35U. S. C. § 119(e) 获得的所有权益。 专利技术背景 专利
公开了在实时聚合酶链反应系统中通过使用新鉴定的靶标元件来确定人DNA样 品的环境降解的程度的方法。 相关领域描述 最近几年，实时聚合酶链反应（PCR)化学已成为对法医样品中基因组的和可 扩增的DNA的量进行可靠地定量的标准。通用系统包括评定总人DNA和男性DNA。实 例为来自生命科技公司的Quantifiler?，来自普洛麦格公司的Pl exor?:和来自凯杰的 Quantiplex?。目前有几种用于基于荧光定量测定的不同方法，包括SYBR?:绿色， Plexor?, TaqMan?, AmpliFluor?，Quantifiler?和Quantiplex?。 使用实时PCR方法以评价DNA样品的降解程度的兴趣渐增。使用两个核DNA靶标 进行这一方法：短的多拷贝序列和长的多拷贝序列。因为随着样品受损，长的靶标序列比 短的靶标序列降解得更迅速，短的靶标与长的靶标的量的比率将提供样品中降解程度的评 价。已发表了使用Alu或微卫星靶标对法医样品中降解的DNA的评价研宄。然而，以前研 宄的测定或缺少灵敏度或不显示高的PCR效率。法医样品在数量和质量方面变化很大，使 得出于对这些样品中的DNA进行定量和确定它们的降解程度的目的开发和验证实时PCR系 统的目标变成挑战。 目前在微型短串联重复（STR)分析系统方面的研宄进展已使得分析高度受损的 样品成为可能。专利技术者在开发STR扩增子方面突飞猛进，与传统的STR扩增子比较，开发 的STR扩增子尺寸减小并且可以对已经显著降解的DNA样品有效（例如见，J. M. Butler 等，J. Forensic Sci. 48 (5) :1054-1064 (2003) ;T.J. Parsons 等，Forensic Science International: Genetics 1:175-179 (2007))〇 Alu为短散步元件（SINE)，约300bp的插入物，其以大拷贝数分布遍及人基 因组。随着时间，Alu元件在人基因组中的进化使得Alu元件非常适合区分人DNA和 非人DNA的任务，并且适用于进行希望对人DNA特异的测试。最近的研宄报道了使用 Ya5系Alu遗传元件评价降解的DNA样品的质量评估（J. A. Nicklas等，J. Forensic Sci. 57 (2) : 466-471 (2012))。用于在证据样品中对人特异性DNA进行定量的基于多 拷贝内Alu的方法已成功地用于获得高灵敏度的DNA定量（J.A.Walker等，Anal. Bi °C hem. 337:89-97 (2005))。 Yb系亚家族元件的平均年龄估计为239万年。据估计人基因组包含超过1800个 Alu Yb家族元件，并且，这些中约50%来自于Yb8亚家族。已知Alu Yb8系统以大量固定 的插入物存在。已报道只有20% Yb系Alu元件为多形态的插入存在或不存在人基因组中 (A.B. Carter等，Human Genomics 1(3) :1_13 (2004))。因为大量这些固定的元件存在于每 个人基因组，当使用多拷贝靶标定量系统时使个别特异的变化可能性最小化。 1994年，Shen等在研宄RP基因的结构时鉴定了新的复合反转录子（Shen等，J. Biol. Chem. 269(11) :8466-8476(1994))。这种新的反转录子由SINE-R元件以及一系列与 Alu序列共享序列相似性的序列组成。因此，在主要组分短散布元件（SINE)，可变数目串联 重复（VNTR)和Alu之后，将其命名为"SVA"。SVA元件包含反转录转座子的标志，因为它们 侧翼是靶位点重复序列（TSD)，以多聚（A)尾结尾，并且在它们整合到基因组期间偶尔为截 短的和反向的。 专利技术概述 本专利技术的目标之一为提供对人DNA样品中存在的降解程度进行定量的方法。 本专利技术的另一目标为提供对样品中人DNA及男性DNA总量进行定量的方法。 本专利技术的另一目标为提供阳性内对照，其通过提供样品中PCR抑制剂的存在的额 外评价而向DNA降解确定的结果方面提供增强的可信性。 本专利技术的另一目标为提供分析师从多个DNA样品中选择最佳的一个用于进一步 的分析关注的方便方法。 本专利技术的另一目标为提供改进的基于DNA样品的降解程度选择用于应用在特定 DNA样品的最佳分析方法的方法。 本专利技术的另一目标为提供评价非人DNA与被测人DNA样品的混合程度的方法。 本专利技术的另一目标为提供评价男性DNA和女性DNA在被测样品中混合程度的方 法。 在本专利技术的一实施方案中，可从以下方法达成这些和其他目标，对样品中人DNA 进行定量以评价其中DNA降解程度的方法，所述方法包括：提供待被分析的样品，使用实时 聚合酶链反应系统以对样品中第一反转录转座子散布元件和第二反转录转座子散布元件 分别进行定量，所述第一反转录转座子散布元件为Alu元件和所述第二反转录转座子散布 元件为RP基因的SVA元件，并且计算样品中第一反转录转座子散布元件的出现率与第二反 转录转座子散布元件的出现率的比率。 在某些实施方案中，同时进行第一反转录转座子散布元件和第二反转录转座子散 布元件的定量。 在某些实施方案中，样品中第一反转录转座子散布元件的出现率与第二反转录转 座子散布元件的出现率的比率可用于确定样品中DNA的降解程度。 在某些实施方案中，第二反转录转座子散布元件包含的碱基对是第一反转录转座 子散布元件包含的碱基对的至少三倍。 在某些实施方案中，本专利技术的方法还包括提供第一探针，所述第一探针包含能够 在第一诊断波长处发荧光的第一部分和能够淬灭第一部分荧光的第一淬灭剂，所述第一探 针靶向于第一反转录转座子散布元件，提供第二探针，所述第二探针包含能够在第二诊断 波长处发荧光的第二部分和能够淬灭第二部分荧光的第二淬灭剂，所述第二探针靶向于第 二反转录转座子散布元件，提供在实时聚合酶链反应系统中有用的至少一种引物，所述系 统能够扩增DNA样品，提供Taq聚合酶，其能够催化形成与样品中存在的核酸序列互补的核 本文档来自技高网...
【技术保护点】
对样品中人DNA进行定量从而评价其中DNA降解程度的方法，所述方法包括以下步骤：提供待分析的样品；使用实时聚合酶链反应系统对样品中第一反转录转座子散布元件和第二反转录转座子散布元件分别进行定量，所述第一反转录转座子散布元件为Alu元件，所述第二反转录转座子散布元件为RP基因的SVA元件；和计算样品中所述第一反转录转座子散布元件的出现率与所述第二反转录转座子散布元件的出现率的比率。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：素德赫·辛哈，
申请(专利权)人：素德赫·辛哈，
类型：发明
国别省市：美国;US
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