本申请提供一种转录组测序方法，在RNA到cDNA的逆转录过程中所使用的引物包含随机序列和特定序列，随机序列位于特定序列的3’端，二者之间有0-5个碱基，随机序列由4-12个随机碱基组成，特定序列为5-30个碱基的同聚体，特定序列的碱基选自A、G、C、T中任意一个。通过对逆转录引物的设计，本发明专利技术既能对带有poly(A)尾的RNA进行测序，又能对不带poly(A)尾的RNA进行测序，进行细胞转录组测序时无需rRNA去除步骤，尤其适用于低起始核糖核酸量和细胞数量的转录组的测序。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种转录组扩增测序检测方法，特别涉及微量样品中能够同时覆盖含 和不含多聚腺苷酸尾巴的核糖核酸种类的扩增测序技术。
技术介绍
随着生命科学研究技术的发展，第二代高通量测序技术的开发，对生物体的研究 越来越详尽和深入，发现生物体内同种细胞间往往存在异质性，这些个体的特征可能是影 响和引导生物体发育的重要因素，所以对单细胞水平的分析越来越重要。尤其是对单细胞 转录组的测序分析，可以直接反应不同细胞间的整体表达差异，反应细胞生长的调控状态。 细胞内的RNA主要包括带有poly(A)尾的mRNA(约占细胞全部RNA的5% )，不带 poly(A)尾的核糖体RNA(rRNA，占细胞全部RNA的90%以上）。对细胞转录组的测序分析 首先需要将不稳定的RNA通过体外逆转录反应变成较为稳定的DNA序列，然后进一步扩增 富集样品，达到标准商业化方法建库的起始量。为了防止含量过多的rRNA污染，目前存在 的单细胞转录组测序方法在逆转录中利用与P〇ly(A)互补配对的寡聚胸腺啼陡（oligdT) 作为引物，使得引物只能与带有poly(A)尾的mRNA结合，不与不带poly(A)尾的rRNA结 合。虽然该做法可以杜绝rRNA的污染，但是同时也将研究对象限定在了带poly(A)尾的RNA 中，其中最为重要的一种是mRNA。随着对转录组研究的不断深入，发现细胞中还存在许多其 他种类的不带poly(A)尾的RNA，比如长非编码核糖核酸（long-noncodingRNA,IncRNA)， 环形核糖核酸（circularRNA)等，它们可能对细胞基因表达存在重要的调控作用，但在逆 转录时以oligdT作为引物的转录组测序方法中，由于引物不与不带poly(A)尾的RNA结 合，该部分RNA的信息无法获得。 另一方面，现有技术中的转录组测序往往针对大量细胞（总核糖核酸在微克级） 进行，为减少rRNA干扰，在进行逆转录之前先用针对细胞中大量存在的rRNA的探针将其去 除之后再进行后续的实验。而在少量细胞、甚至是单细胞的转录组测序时，由于去除rRNA 的步骤而带来的其他RNA的损失是无法承受的。
技术实现思路
针对现有技术中存在的无法对转录组中不带poly(A)尾的RNA进行测序，尤其是 无法对少量细胞转录组中不带poly(A)尾的RNA进行测序的问题，本专利技术提供了一种能够 逆转录出所有种类的RNA并将其扩增建库的方法，该方法使用包含随机序列的"随机引物" 进行逆转录，不依赖P〇ly(A)尾，因此可以覆盖所有核糖核酸种类。同时，由于反应温度条 件的控制，可以减少rRNA的污染。 本专利技术提供，在RNA到CDNA的逆转录过程中所使用的引物包 含随机序列和特定序列，随机序列位于特定序列的3'端，二者之间有0-5个碱基，随机序 列由4-12个随机碱基组成，优选由6-8个随机碱基组成（A、T、G、c中任意组合成六-八聚 体），特定序列为5-30个碱基的同聚体，优选为10-20个碱基的同聚体，更优选为15个碱基 的同聚体，特定序列的碱基选自A、G、C、T中任意一个。传统利用oligdT作为引物的方法 中，由于引物结合位置都只能结合在mRNA链末端的聚腺苷酸尾巴上，导致绝大部分情况下 能够覆盖的片段都在整条核糖核酸链的末尾段，不利于研究基因转录的完整性以及揭示可 变剪切等现象。本专利技术的随机引物理论上可以结合整条核糖核酸链的各个部位，因此可以 大大提高逆转录的均匀性，反映细胞中转录本的真实状态。虽然随机引物可以随机的与任 何序列结合，但是由于引物本身设计在随机组合的4-12个核糖核苷酸之后连接5-30个胸 腺啼陡（T)，更倾向于结合具有poly(A)尾的RNA序列，使得利用本方法对核糖体核糖核酸 的逆转录非常少（小于2% )，不对测序数据造成损失，同时同聚体的存在也很少引入引物 多聚体等人为的污染。 在该方法中，无需去除核糖体RNA。 在该方法中，所述的引物还包括锚定序列，锚定序列为cDNA扩增步骤中PCR引物 序列。 在该方法中，所述RNA起始量为少量，甚至为单细胞当量，RNA起始量为 0?lpg-100ng，优选10pg-500pg。相应的细胞数量为1-10000个，优选1-100个，更优选1-10 个。 在该方法中，逆转录之前加热以释放细胞中的RNA并破坏其二级结构，加热的温 度为60-80°C，加热时间为10s-3min，优选30s-120s，更优选90s。rRNA具有比mRNA更为丰 富的二级结构。传统步骤中，逆转录前对RNA65C5min的加热会使rRNA结构充分打开，使在 后续步骤中引入rRNA干扰。而本方法通过精确控制加热温度和时间，使细胞中的RNA充分 释放，同时避免打开rRNA的二级结构，从而减少对rRNA的逆转录。 该方法包括如下步骤：（1)加热，（2)逆转录反应获得cDNA-链，（3)消化未反应 的引物，（4) 一链cDNA加polyA尾，（5)二链cDNA合成，（6)cDNA模板扩增反应，（7)扩增产 物的纯化，（8)扩增cDNA片段的筛选，（9)二轮扩增，（10)二轮扩增产物纯化及片段筛选， cDNA文库构建及测序。 在该方法中，一链cDNA加polyA尾的过程中，加入dATP和ddATP，所加入的dATP 和ddATP的摩尔比为50-200 :1，优选100 :1。传统扩增方法实现单细胞核糖核酸测序技术 在第一条互补脱氧核糖核酸链（cDNA)形成后，直接加入末端转移酶和一定浓度的脱氧腺 嘌呤核苷酸（dATP)，在末端加上一段聚腺苷酸，作为第二条互补脱氧核糖核酸链合成的引 物结合区。这一步往往由于酶的效率过高，在单细胞反应体系的小体系中（5ul)很难再修 改加入反应物的浓度和体积，导致合成的聚腺苷酸尾巴过长，污染测序数据。我们在专利技术中 引入双脱氧腺嘌呤（ddATP)，一端可以与dATP结合，但结合之后另一端无法再继续结合其 他碱基，这样就可以终止聚脱氧腺嘌呤链的继续延长。本专利技术中，我们以双脱氧腺嘌呤：脱 氧腺嘌呤=1 :1〇〇的比例加入反应体系，可以合理控制添加的聚脱氧腺嘌呤链的长度，从 而使得测序得到的有效数据比例更高。 本专利技术提供了一套完整的单细胞测序实验技术，得到的样品直接用于核酸文库构 建操作，所以需要达到一定的文库构建起始量，需要两轮PCR(聚合酶链式反应）扩增反应， 第一轮和第二轮PCR反应的循环数分别是16-20,8-10不等，需要根据实验起始细胞量的大 小（总的核糖核酸含量多少）决定。以l〇pg核糖核酸起始量为例，第一轮和第二轮扩增分 别需要20和10个循环。本方法尤其适用于微量实验，虽然测序结果显示，随着起始核糖 核酸量的增加，会有更多的基因被覆盖，但是ng级别的核糖核酸起始量已经达到饱和，过 度的扩增会带来更大的噪声，超过lng的样品起始量得到的实验结果稳定性可能反而不如 100pg〇 使用本专利技术的单细胞核糖核酸测序技术拥有很高的技术重复性，在研究细胞间差 异时可以排除技术误差，适于分析单细胞及微量核糖核酸样品中含聚腺苷酸尾巴和不含聚 腺苷酸尾巴的核糖核酸，从而可以更全面研究单细胞转录组，对更多未知的核糖核酸展开 研究。 本专利技术的有益效果是：（1)既能对带有poly(A)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种转录组测序方法，其特征在于，在RNA到cDNA的逆转录过程中所使用的引物包含随机序列和特定序列，随机序列位于特定序列的3’端，二者之间有0‑5个碱基，随机序列由4‑12个随机碱基组成，特定序列为5‑30个碱基的同聚体，特定序列的碱基选自A、G、C、T中任意一个。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄岩谊，汤富酬，范小英，张先念，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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