斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因克隆、重组表达方法及应用技术

本发明专利技术公开了斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因克隆、重组表达方法及应用，通过斯氏副柔线虫转录组测序，预测出的编码基因与已公布的线虫数据库比对分析，找出斯氏副柔线虫特有基因，用RT‑PCR方法从斯氏副柔线虫中扩增出特有基因Pj_CPI，克隆测序后，构建到原核表达载体pET30a中，转化至E.coli BL21，进行诱导表达，用Western‑bloting法验证重组蛋白rCPI的免疫原性。斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因重组蛋白经纯化后，建立了家畜斯氏副柔线虫iELISA检测方法。

Pj_CPI gene cloning, recombinant expression method and application of cysteine protease inhibitor of S.

The present invention discloses STEVENSI cloning, vice habronema cysteine protease inhibitor Pj_CPI gene recombinant expression method and application of Parabronema skrjabini by transcriptome sequencing, analysis of nematode database gene encoding the predicted and published, identify Parabronema skrjabini specific gene RT was amplified by PCR method from Adams in a special side's soft nematode gene Pj_CPI, cloning and sequencing, to construct the prokaryotic expression vector pET30a and transformed into E.coli BL21, induced by the immunogenicity of Western validated by bloting recombinant protein rCPI. After purification of the recombinant protein Pj_CPI of cysteine protease inhibitor iELISA, a method for the detection of s..

【技术实现步骤摘要】
斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因克隆、重组表达方法及应用
本专利技术属于生物
，具体地说，涉及斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因克隆、重组表达方法及应用。
技术介绍
斯氏副柔线虫病由斯氏副柔线虫(Parabronemaskrjabini)寄生于骆驼、羊、牛等反刍动物真胃引起,尤以骆驼感染较为严重。大量虫体寄生可导致患畜真胃发生炎症、出血、溃疡,严重者造成骆驼死亡,对养驼业危害极大，是危害我国养驼业的一种主要寄生虫病，长期以来,给农牧民带来了巨大的经济损失。因此，今后对斯氏副柔线虫病的监测和防制是骆驼等反刍动物寄生虫病防治中的重点。由于世界上绝大多数骆驼都分布在第三世界国家的落后地区，所以时至今日，国内外关于斯氏副柔线虫病的研究报道较少。严重危害我国骆驼养殖业的斯氏副柔线虫病的相关研究滞后，在斯氏副柔线虫病的防治上，目前存在的主要问题是缺少针对该病的基础理论研究、缺乏有效的生前诊断方法和防治的新方法。适用于许多寄生性线虫的粪便虫卵检查法用于该病的诊断，检出率非常低，很难用于临床实践。该病的诊断主要依靠死后剖检(在真胃查找虫体)，此类诊断方法不能为早期治疗提供参考。在实际的生产中，往往是在没有诊断依据的情况下盲目地给药驱虫，造成经济损失的同时也带来了诸如毒副作用、出现耐药虫株和畜产品药物残留超标等诸多弊端。当前，在生产实践中亟待研究斯氏副柔线虫病的生前诊断方法，为该病的防制提供科学依据，使该病的防制更有针对性，提高防制效果，避免不必要的经济投入，同时为该病的监测提供科学的技术手段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因克隆、重组表达方法及应用。该方法通过斯氏副柔线虫转录组测序预测出的编码基因与已公布的线虫数据库比对分析，找出斯氏副柔线虫特有基因并进行功能注释，用RT-PCR方法从斯氏副柔线虫中扩增出特有基因Pj_CPI，克隆测序后，构建到原核表达载体pET30a中，转化至E.coliBL21(DE3)，进行诱导表达，用western-bloting法验证Pj_CPI重组蛋白的免疫原性。其具体技术方案为：斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因的编码蛋白，其核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。用于扩增权利要求1所述权利要求1所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因的特异性PCR引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：3、SEQIDNO：4所示。本专利技术所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因在检测和防治家畜斯氏副柔线虫感染过程中的应用。斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因的克隆、重组表达方法，包括以下步骤：步骤1、引物设计根据Pj_CPI的基因序列，用Oligo6.0设计引物，分别在上游引物和下游引物中插入限制性内切酶EcoRI、XhoI酶切位点，引物的合成由华大基因有限公司完成。步骤2、斯氏副柔线虫总RNA的提取按照TaKaRaRNAisoPlusRNA提取试剂说明书提取斯氏副柔线虫总RNA，具体步骤如下：1.样品的研磨和匀浆：将液氮中保存的斯氏副柔线虫样品迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。然后，向研钵中加入适量的RNAisoPlus，反复吹打，至均一透明；然后，将匀浆液转移至离心管中，室温(15-30℃)静置5min；12000g4℃离心5min；小心吸取上清液，移入新的离心管中。2.总RNA的提取：向上述匀浆裂解液中加入氯仿(RNAisoPlus的1/5体积量)，盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色；室温静置5min；12000g4℃离心15min；从离心机中小心取出离心管(此时匀浆液分为三层，即：无色含RNA的上清液、中间白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。)吸取上清液转移至另一新的离心管中；向上清中加入0.5-1倍RNAisoPlus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10min；12000g4℃离心10min。3.RNA沉淀的清洗：小心弃去上清液。加入与RNAisoPlus等量的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7500g4℃离心5min后小心弃去上清液。4.RNA的溶解：打开离心管盖，室温干燥沉淀数分钟；沉淀干燥后，加入适量的RNase-free水溶解沉淀。步骤3、Pj_CPI基因RT-PCR扩增以提取的斯氏副柔线虫总RNA为模板反转录为cDNA，然后以cDNA为模板，用上述设计的特异性引物PCR扩增Pj_CPI基因并对其特有性进行验证。PCR扩增反应条件为：预变性94℃5min；变性94℃30sec，退火57℃1min，延伸72℃1.5min，35个循环；再延伸72℃10min。PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测。步骤4、PCR产物回收按照AxygenPCR产物回收试剂盒说明书操作，回收Pj_CPI基因PCR产物。步骤5、PCR回收产物与pMD19-TSimple载体的连接取200μL离心管加1μLpMD19-TSimpleVector、4μLPCR回收产物和5μLSolutionⅠ，离心混匀，16℃过夜连接。步骤6、重组质粒的转化按照北京全式金生物技术有限公司Trans1-T1感受态细胞使用说明书操作，将连接产物转化于Trans1-T1感受态细胞中，涂布于含抗生素(Amp)的固体LB培养基上，37℃培养过夜。步骤7、重组克隆菌PCR鉴定挑取阳性菌落，接种到含抗生素的液体LB培养基中培养过夜，以培养物做PCR扩增鉴定。步骤8、重组克隆质粒的双酶切鉴定按照Axygen质粒提取试剂盒说明书提取重组质粒，用限制性内切酶XhoI和EcoRⅠ对重组质粒进行双酶切和电泳检测。步骤9、重组克隆菌测序经PCR鉴定及质粒双酶切鉴定均为阳性的重组克隆菌，送北京华大基因公司进行双向测序。步骤10、目的基因与表达载体pET30a的回收将测序正确的克隆菌株和含有pET30a质粒的菌株分别接种于LB培养基中培养过夜，分别提取质粒，用限制性内切酶XhoI和EcoRⅠ对重组克隆质粒和pET30a质粒进行双酶切和电泳检测，胶回收目的基因片段和pET30a片段。步骤11、目的基因与表达载体pET30a的连接取200μL离心管加入6μL回收的目的片段、2μLpET30a表达载体片段、1μLT4DNA连接酶和1μLbuffer，16℃连接过夜；构建重组表达质粒(pET30a-Pj_CPI，以下简称为pETCPI)如SEQIDNO:2所示。步骤12、重组表达质粒转化感受态细胞按照北京全式金(TransGenBiotech)生物技术有限公司E.coliBL21(DE3)感受态细胞使用说明书操作，将连接产物转化于E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含抗生素的固体LB培养基上37℃培养过夜。步骤13、重组表达菌的鉴定对构建的重组表达菌E.coliBL21(pETCPI)，以下简称BL21(pETCPI)进行PCR鉴定和双酶切鉴定，经PCR鉴定及质粒双酶切鉴定均为阳性的重组表达菌，送北京华大基因公司进行双向测序，本文档来自技高网...

【技术保护点】
斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.权利要求1所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因的编码蛋白，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。3.用于扩增权利要求1所述权利要求1所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因的特异性PCR引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：3、SEQIDNO：4所示。4.权利要求1所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因在检测和防治家畜斯氏副柔线虫感染过程中的应用。5.斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Pj_CPI基因克隆、重组表达方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、引物设计根据Pj_CPI的基因序列，用Oligo6.0设计引物，分别在上游引物和下游引物中插入限制性内切酶EcoRI、XhoI酶切位点，引物的合成由华大基因有限公司完成；步骤2、斯氏副柔线虫总RNA的提取按照TaKaRaRNAisoPlusRNA提取试剂说明书提取斯氏副柔线虫总RNA，具体步骤如下：21)样品的研磨和匀浆：将液氮中保存的斯氏副柔线虫样品迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状；然后，向研钵中加入适量的RNAisoPlus，反复吹打，至均一透明；然后，将匀浆液转移至离心管中，室温15-30℃静置5min；12000g4℃离心5min；小心吸取上清液，移入新的离心管中；22)总RNA的提取：向上述匀浆裂解液中加入氯仿，RNAisoPlus的1/5体积量，盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色；室温静置5min；12000g4℃离心15min；从离心机中小心取出离心管吸取上清液转移至另一新的离心管中；向上清中加入0.5-1倍RNAisoPlus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10min；12000g4℃离心10min；23)RNA沉淀的清洗：小心弃去上清液；加入与RNAisoPlus等量的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7500g4℃离心5min后小心弃去上清液；24)RNA的溶解：打开离心管盖，室温干燥沉淀数分钟；沉淀干燥后，加入适量的RNase-free水溶解沉淀；步骤3、Pj_CPI基因RT-PCR扩增以提取的斯氏副柔线虫总RNA为模板反转录为cDNA，然后以cDNA为模板，用上述设计的特异性引物PCR扩增Pj_CPI基因并对其特有性进行验证；PCR扩增反应条件为：预变性94℃5min；变性94℃30sec，退火57℃1min，延伸72℃1.5min，35个循环；再延伸72℃10min；PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测；步骤4、PCR产物回收按照AxygenPCR产物回收试剂盒说明书操作，回收Pj_CPI基因PCR产物；步骤5、PCR回收产物与pMD19-TSimple载体的连接取200μL离心管加1μLpMD19-TSimpleVector、4μLPCR回收产物和5μLSolutionⅠ，离心混匀，16℃过夜连接；步骤6、重组质粒的转化按照北京全式金生物技术有限公司Trans1-T1感受态细胞使用说明书操作，将连接产物转化于Trans1-T1感受态细胞中，涂布于含抗生素Amp的固...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘春霞，冯陈晨，王文龙，呼和巴特尔，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15